張月蓮 王 歡 窄靜麗 王晶晶

1.山西醫(yī)學科學院，山西大醫(yī)院(太原， 030032)；2. 深圳鹽田區(qū)人民醫(yī)院3. 太原煤氣化職工醫(yī)院醫(yī)院

·臨床研究·

Ang-1、Ang-2、MVD與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究

張月蓮1王 歡2窄靜麗3王晶晶1

1.山西醫(yī)學科學院，山西大醫(yī)院(太原， 030032)；2. 深圳鹽田區(qū)人民醫(yī)院3. 太原煤氣化職工醫(yī)院醫(yī)院

目的：通過觀察復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)患者絨毛、蛻膜組織中血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)的表達及微血管密度(MVD)，探討Ang-1、Ang-2與血管生成及RSA的關(guān)系。方法：選擇2013年5 ～11月在山西大醫(yī)院婦產(chǎn)科門診行流產(chǎn)清宮術(shù)的RSA患者30例(RSA組)，既往有正常胎兒分娩史、自愿行人工流產(chǎn)的正常早孕婦女30例(正常組)。在人工流產(chǎn)的同時留取絨毛及蛻膜組織，經(jīng)免疫組化SP法檢測Ang-1、Ang-2 、CD34在兩組絨毛及蛻膜組織中的表達水平，計數(shù)抗-CD34單抗標染的MVD，分析它們與RSA的關(guān)系。結(jié)果：①RSA組絨毛組織中Ang-1、Ang-2的表達及Ang-1/Ang-2比值均高于正常組(P<0.05)；蛻膜組織中Ang-1、Ang-2的表達均低于正常組(P<0.05)。兩組蛻膜中Ang-1/Ang-2比值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；②RSA組中，絨毛Ang-1、Ang-2表達均高于蛻膜，Ang-1/Ang-2比值低于蛻膜(P<0.05)；正常組中，絨毛中Ang-1表達低于蛻膜(P<0.001)，Ang-2在絨毛、蛻膜組織中表達無統(tǒng)計學差異，絨毛Ang-1/Ang-2比值低于蛻膜(P<0.05)。 ③RSA組絨毛組織及蛻膜組織中MVD值低于正常組(P<0.05)。結(jié)論：Ang-1、Ang-2的過度表達可能是導致血管生成缺陷及自然流產(chǎn)的原因之一，Ang-1過度表達對血管生成缺陷的影響可能更大。

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；血管生成素-1；血管生成素-2；微血管密度；免疫組化

復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RSA)是婦產(chǎn)科常見病，發(fā)病率約為育齡婦女的1%～3%[1]，因其病因復(fù)雜，治療較棘手，往往給欲生育的夫婦及家庭帶來一定的精神、心理負擔。RSA的病因可為胚胎染色體異常、母體黃體功能不全、子宮畸形、宮頸內(nèi)口松弛等。但目前仍有近50%的RSA原因不清，由于妊娠從受精卵著床到胎盤形成及胚胎、胎兒的發(fā)育都與血管的生成及豐富的血液供應(yīng)有著密切的關(guān)系，而血管生成素(Ang)于妊娠早期即有表達。為了探討Ang與RSA的關(guān)系，本研究對RSA患者的絨毛及蛻膜組織進行了Ang-1、Ang-2、CD34的測定。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇自2013年5～11月在山西醫(yī)學科學院山西大醫(yī)院婦產(chǎn)科門診行流產(chǎn)清宮術(shù)患者60例，其中RSA(≥2次自然流產(chǎn))30例(RSA組)，正常妊娠行人工流產(chǎn)的婦女30例(正常組)。RSA組: ①孕婦年齡28.1±5.8(20～40)歲；②夫婦染色體檢查無異常；③超聲檢查子宮發(fā)育無畸形；④甲狀腺功能檢查無異常；⑤無血栓形成傾向；⑥排除免疫及感染因素影響。 正常組：①孕婦年齡27.9±5.0(20～40)歲 ；②既往有正常分娩史而無不良孕產(chǎn)史；③本次妊娠無流產(chǎn)癥狀；④超聲確診早孕，可見胚芽及心管搏動。征得研究對象同意后在人工流產(chǎn)時留取標本。兩組對象孕周、孕次、年齡經(jīng)t檢驗無統(tǒng)計學差異。

1.2 實驗方法

1.2.1 Ang-1、Ang-2、CD34表達的檢測 RSA組因流產(chǎn)先兆行清宮術(shù)及正常組清宮后得到的新鮮絨毛和蛻膜組織，生理鹽水漂洗，10%甲醛溶液固定12～24 h后石蠟包埋切片后，按試劑說明(北京博奧森生物科技有限公司)行免疫組化SP法檢測Ang-1、Ang-2、CD34的表達 。采用病理圖像分析系統(tǒng)(ScanScope CS, Gene Company Limited)掃描并截圖，用Image-Pro Plus Version 6.0圖像分析軟件對每張切片截圖的陽性區(qū)域進行Ang-1、Ang-2定量檢測，測定陽性產(chǎn)物的積分光密度值(IOD值)。陽性反應(yīng)越強烈，染色越深，IOD值則越大。

1.2.2 CD34陽性及微血管密度(MVD)的判定 采用SP法用CD34單克隆抗體工作液對組織血管進行免疫組化染色，顯微鏡下觀察，以血管內(nèi)皮細胞胞漿呈棕黃色為CD34陽性表達，根據(jù)CD34標記的血管內(nèi)皮的數(shù)目計數(shù)微血管數(shù)量，將管腔<8個紅細胞的血管或血管內(nèi)皮細胞簇(包括單個內(nèi)皮細胞著色)作為一個計數(shù)單位。MVD計算方法：按照Weidner[2]等的方法，每張切片在顯微鏡下放大400倍，計數(shù)5個視野微血管數(shù)目，取其平均值為該張切片的微血管密度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 兩組組織中Ang-1、Ang-2的表達比較

兩組絨毛組織的滋養(yǎng)層細胞、 間質(zhì)細胞的胞漿內(nèi)均有Ang-1、Ang-2的表達；兩組蛻膜組織腺上皮細胞及基質(zhì)細胞胞漿內(nèi)存在Ang-1、Ang-2的表達。RSA組中，絨毛中Ang-1、Ang-2、Ang-1/Ang-2比值與蛻膜中相比有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；在正常組中，絨毛中Ang-1、Ang-1/Ang-2比值與蛻膜中相比有差異(P<0.001)。RSA組絨毛中Ang-1、Ang-2、Ang-1/Ang-2表達高于正常組相應(yīng)組織，而蛻膜組織Ang-1、Ang-2的表達均低于正常組相應(yīng)部位，具有統(tǒng)計學差異。見圖1～圖4，見表1。

2.2 兩組不同組織中MVD值

絨毛及蛻膜組織中MVD值在RSA組低于正常組(P<0.05)，且RSA組蛻膜組織的MVD低于絨毛組織(P<0.05)；正常組兩組織中的MVD無差異(P>0.05)。見圖5，表2。

表1 兩組不同組織中Ang-1、Ang-2 IOD值比較

*表示有統(tǒng)計學意義

表2 兩組不同組織中MVD的比較

組織 絨毛蛻膜tPRSA組20．1±1．514．2±3．211．10<0．05正常組29．8±4．027．9±12．60．67>0．05t2．572．14P<0．05<0．05

3 討論

妊娠的發(fā)展依賴于胎盤絨毛的正常發(fā)育及血管生成，血管生成的調(diào)節(jié)需依靠血管生成刺激因子和抑制因子之間的平衡來調(diào)節(jié)。目前認為血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體Flt-1等的調(diào)節(jié)途徑、Angs /酪氨酸激酶受體(Tie2)調(diào)節(jié)途徑、Dll4(配體delta-like ligand 4)-Notch調(diào)節(jié)途徑在血管生成中相互影響并發(fā)揮重要作用[3]。

Angs家族中成員 Ang-1、Ang-2均作用于內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶Tie-2，可影響內(nèi)皮的增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)的形成，從而在血管形成中發(fā)揮重要作用，Ang-1是Tie-2的生理性配體及激動劑，其與Tie-2結(jié)合后, 使血管周圍細胞和平滑肌細胞發(fā)生聚集, 有利于維持血管壁的完整性, 促進血管的重塑、成熟以及促進血管出芽及分支。Ang-2與Tie-2 結(jié)合的作用復(fù)雜，目前效應(yīng)不清，認為Ang-2為Ang-1的天然競爭拮抗劑，其功能主要是與Ang-1競爭性地結(jié)合血管內(nèi)皮細胞的Tie-2受體，從而誘導內(nèi)皮細胞發(fā)生分裂、移位，使新生血管呈非出芽式生長[4]。布占紅[5]等曾對米非司酮藥流后絨毛及蛻膜組織進行了Ang-1檢測，發(fā)現(xiàn)Ang-1在用藥組蛻膜、絨毛組織中的表達均顯著低于對照組，認為用藥后使Ang-1的表達受到抑制，影響胚胎血管的正常生成，導致流產(chǎn)發(fā)生。也有研究發(fā)現(xiàn)[6]RSA患者的絨毛組織中Ang-1的表達顯著增高。本研究中，RSA組與正常妊娠組相比，絨毛中Ang-1、Ang-2表達均增多，與上述研究結(jié)果相一致。同時發(fā)現(xiàn)絨毛組織中MVD值在RSA組明顯低于正常組，推測Ang-1、Ang-2的過度表達造成絨毛血管形成障礙，影響胚胎發(fā)育可能是導致流產(chǎn)發(fā)生的原因。 本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然RSA組蛻膜組織中Ang-1、Ang-2表達低于正常組蛻膜組織，但其Ang-1/Ang-2高于正常組，MVD低于正常組，提示血管的生成與Ang-1/Ang-2的比例有關(guān)，比例失調(diào)可能導致血管生成的減少，影響胚胎的營養(yǎng)供給，致使流產(chǎn)發(fā)生。但鑒于本研究中病例較少，對其比值大小及Ang-1、Ang-2的表達水平?jīng)]能做出更具體的分析，有待于未來進一步的研究。

總之，妊娠期Ang-1、Ang-2在絨毛、蛻膜均有表達，Ang-1、Ang-2 調(diào)節(jié)途徑可能參與了胚胎的發(fā)育、胎盤血管的形成、重建等過程，一旦Ang-1、Ang-2表達異常或平衡失調(diào)將會影響胎盤血管網(wǎng)發(fā)育，影響母胎之間氣體和營養(yǎng)物質(zhì)的交換，導致流產(chǎn)等發(fā)生。

[1] Carrington B,Sacks G,Regan L.Recurrent miscarriage:Pathophysiology and outcome[J].Curr Opin Obstet Gynecol,2005,17(6):591-597.

[2] Weidner N, Folkman J, Pozza F, et al . Tu mor angiogenes is:a new significant and in dependent pr ogn os tic indicator in early stage breast carcinoma[J].J Natl Cancer Inst, 1992, 84( 24) : 1875-1887.

[3] 孫曉佳，張月英，張雛東. 血管生成主要信號通路[J]. 國際腫瘤學雜志，2010，2(37)：95-97.

[4] Dunk C,Shams M,Nijiar S,et al. Angiopoietin-1 and angiopoietin- 2 activate trophoblast Tie-2 to promote growth and migration during placental development[J]. Am J Pathol，2000，156(6):2185-2199.

[5] 布占紅，熊小琴 ，田菲，等.VEGF、Ang-1在米非司酮藥流前后絨毛和蛻膜組織中的表達及意義[J].中國傷殘醫(yī)學雜志，2014，22(6)：52-53.

[6] 陳朝軍.促血管生成素-1與反復(fù)自然流產(chǎn)的臨床相關(guān)性分析[J].中國實用醫(yī)藥雜志 , 2014，9(24):123-124.

[責任編輯：王麗娜]

Study on the correlation between Angiogenin 1, Angiogenin 2，microvascular density and recurrent spontaneous abortion

ZHANG Yuelian1,WANG Huan2, ZHAI Jingli3, WANG Jingjing1

1.ShanxiAcademyofMedicalSciences,ShanxiDayiHospital,Shanxi, 030032; 2.Thepeople'shospitalofYantiandistrictofShenzhen,3.Taiyuancoalgasificationworkerhospital

Objective: To explore the relationship between Angiogenin(Ang)1, Ang2，micro vascular density(MVD) and recurrent spontaneous abortion(RSA) by observing the expression of Ang 1, Ang 2 and MVD in chorionic and decidua tissues of patients with recurrent spontaneous abortion. Method：From May 2013 to November 2013, 30 patients with RSA who came to Shanxi Dayi hospital for induced abortion were included in RSA group, and another 30 patients experienced abortion because of unwanted pregnancy or given birth to normally were included in normal group. Chorionic and decidua tissues of every patient had been collected. Expression level of Ang 1, Ang 2，CD34 in Chorion and decidual tissues were detected by immunohistochemical SP method, and the relationship between Ang1, Ang2，MVD and RSA was analyzed. Result: 1.Expression level of Ang 1, Ang 2 and Ang 1/ Ang 2 in chorionic tissue of patients of RSA group were higher than those of patient in normal group (P< 0.05). Expression level of Ang 1, Ang 2 in decidua tissue was lower than those of patients in normal group (P< 0.05). Ang 1/Ang 2 in deciduas tissue of two groups had no statistical significance (P>0.05). 2. In the RSA group, expression level of Ang 1, Ang 2 in chorionic tissue was significantly higher than those of patients in decidua tissue (P< 0.05),but Ang 1/Ang 2 was lower in decidua tissue (P< 0.05). In normal group, expression level of Ang 1 in chorionic tissue were significantly lower than those of patients in decidua tissue (P< 0.001), expression level of Ang 2 in chorionic tissue and in decidua tissue was same, but Ang 1/Ang 2 was lower in chorionic tissue (P< 0.05). 3. MVD in chorionic and decidua tissue of patients in RSA group was significantly lower than that of patients in normal group (P<0.05).Conclusion: The excessive expression of Ang 1 and Ang 2 in chorionic and decidual tissues in RSA group may be one of reason of angiogenesis defect and RSA. The excessive expression of Ang 1 maybe has heavier effect on angiogenesis defect.

Repeated spontaneous abortion;Angiogenin 1;Angiogenin 2;Microvascular density;Immunohistochemistry

2015-08-24

2016-06-18

10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.08