常　青，閆　超，俞　蓉，高燕敏，歐陽(yáng)冰，孫紅妹

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2015年春季無(wú)錫地區(qū)兒童肺炎支原體及呼吸道常見(jiàn)致病菌的分析

常青1，閆超2，俞蓉1，高燕敏1，歐陽(yáng)冰1，孫紅妹2

目的了解無(wú)錫地區(qū)下呼吸道感染住院患兒肺炎支原體耐藥情況及呼吸道常見(jiàn)致病菌的分布，為預(yù)防和治療提供依據(jù)。方法采用PCR法檢測(cè)患兒咽拭子中的肺炎支原體及其耐藥基因，采用real-time PCR法檢測(cè)其他呼吸道常見(jiàn)致病菌。結(jié)果共檢測(cè)標(biāo)本288例，檢出病原菌59例，陽(yáng)性檢測(cè)率為20.5%。細(xì)菌檢出率隨年齡增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，<2歲兒童陽(yáng)性檢出率最高，且女性高于男性。病原菌構(gòu)成比分別為：肺炎支原體28.8%(17/59)，KP為30.5%(18/59)，SA為20.3%(12/59)，PA為20.3%(12/59)，SE為15.3%(9/59)，HI為10.2%(6/59)，SP為5.08%(3/59)，LP為5.08%(3/59)，EC，CP，TB均為0例(0%)。其中肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率為88.2%，10例存在合并感染。結(jié)論無(wú)錫地區(qū)住院患兒下呼吸道感染的病原菌以肺炎支原體和肺炎克雷伯桿菌為主，且大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥率較高。

肺炎支原體；耐藥；呼吸道常見(jiàn)病原菌；兒童；無(wú)錫

Supported by the Wuxi Municipal Commission of Health and Family Planning (Woman and Child Health Scientific Research Project)

呼吸道感染是兒童最常見(jiàn)的疾病，可引起兒童急性支氣管炎、肺炎，嚴(yán)重者可引起呼吸衰竭和心力衰竭，對(duì)患兒的危害較大。據(jù)聯(lián)合國(guó)兒童基金會(huì)統(tǒng)計(jì)，全世界每年約有350萬(wàn)左右5歲兒童死于肺炎；我國(guó)每年<5歲兒童因肺炎死亡者約35萬(wàn)人[1]。其中，肺炎支原體(Mycoplasmapneumoniae, MP)是引起兒童呼吸道感染的重要致病菌之一，臨床癥狀可從輕微的咽炎、支氣管炎到重癥肺炎，嚴(yán)重感染可導(dǎo)致死亡[2]。MP引起的肺炎，占社區(qū)獲得性肺炎的20%左右，流行高峰年其感染率可達(dá)30%以上[3]。此外，兒童呼吸道常見(jiàn)病原菌主要包括肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，SP)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae，KP)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus, SA)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis，SE)、流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae，HI)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli，EC)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)、結(jié)核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，TB)、肺炎衣原體(Chlamydiapneumoniae，CP)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila，LP)等[4]。此前，關(guān)于無(wú)錫地區(qū)呼吸道感染的相關(guān)報(bào)道較多，但關(guān)于肺炎支原體與呼吸道感染及其他常見(jiàn)致病菌關(guān)系以及肺炎支原體耐藥分析方面的報(bào)道較少。

本研究收集下呼吸道感染住院患兒標(biāo)本，進(jìn)行肺炎支原體及其他呼吸道常見(jiàn)致病菌檢測(cè)，了解呼吸道感染中肺炎支原體與其他常見(jiàn)病原菌的構(gòu)成關(guān)系，以及肺炎支原體耐藥情況，對(duì)無(wú)錫地區(qū)2015年春季兒童呼吸道感染現(xiàn)狀進(jìn)行分析。

1　材料和方法

1.1研究對(duì)象與標(biāo)本采集2015年2-5月，無(wú)錫市第八人民醫(yī)院兒科住院下呼吸道感染的患兒標(biāo)本288例，來(lái)自無(wú)錫市各區(qū)，下呼吸道感染診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》第7版，排除標(biāo)準(zhǔn)：支氣管肺發(fā)育不良，先天性心臟病，免疫缺陷病等。標(biāo)本類(lèi)型為咽拭子(用無(wú)菌咽拭子，在被檢測(cè)患兒咽后壁采集分泌物)。其中，2015年2月127例(44.1%)，3月35例(12.2%)，4月55例(19.1%)，5月71例(24.7%)；男166例(57.6%)，女122例(42.4%)；年齡為7月～13歲，平均年齡為3歲9月。其中<1歲28例(9.72%)，1～2歲82例(28.5%)，3～6歲144例(50.0%)，7～13歲34例(11.8%)。

1.2研究方法

1.2.1標(biāo)本DNA提取采用Qiagen 的QIAamp DNA提取試劑盒對(duì)上述呼吸道標(biāo)本進(jìn)行DNA提取，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DNA提取后保存于-20 ℃用于呼吸道常見(jiàn)病原菌檢測(cè)。

1.2.2肺炎支原體檢測(cè)采用首都兒科研究所細(xì)菌研究室設(shè)計(jì)的引物[5]，針對(duì)肺炎支原體的基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列區(qū)域Mpn14進(jìn)行擴(kuò)增，片段長(zhǎng)度為243 bp。25 μL PCR反應(yīng)體系中包含2× Taq PCR MasterMix (天根生化科技北京有限公司)12.5 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物濃度均為0.4 μmol/L。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min擴(kuò)增35個(gè)循環(huán), 72 ℃再延伸 10 min。在Veriti 96-well 熱擴(kuò)增儀(Applied Biosystems，美國(guó))上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠觀(guān)察結(jié)果。陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物由invitrogen 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，并利用Basic Local Alignment Search Tool analysis (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3肺炎支原體耐藥基因檢測(cè)采用李少麗等文獻(xiàn)中報(bào)道的nPCR-SSCP-CE法，結(jié)合套式PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)和毛細(xì)管電泳(CE)的方法，分析Mp 23S rRNAV區(qū)中常見(jiàn)的耐藥基因突變位點(diǎn)2063和2064[6]。存在突變的擴(kuò)增產(chǎn)物由invitrogen 英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果利用Blast進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證常見(jiàn)耐藥突變位點(diǎn)是否發(fā)生突變。

1.2.4其他呼吸道常見(jiàn)致病菌檢測(cè)參照首都兒科研究所細(xì)菌研究室設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增Sp，Kp，Sa，Se及Hi[7]，此外利用primer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增Cp，Lp，Tb，Pa，Ec。用DNA分析軟件(http://www.sigma-genosys.com/calc/DNACalc.asp)評(píng)價(jià)引物之間有無(wú)二聚體及環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行Blast比對(duì)，檢測(cè)引物特異性。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增片度長(zhǎng)度見(jiàn)表1。采用real-time PCR(SYBR Green I)法，擴(kuò)增目的片段。20 μL PCR反應(yīng)體系中包含2× SuperReal PreMix Plus with SYBR Green I(天根生化科技北京有限公司)10 μL，5 μL模板DNA，上、下游引物濃度均為0.25 μmol/L。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性8 min, 95 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分析過(guò)程中應(yīng)用了卡方檢驗(yàn)，兩兩比較過(guò)程中采用配對(duì)設(shè)計(jì)四格表卡方檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1肺炎支原體檢測(cè)結(jié)果288例下呼吸道感染標(biāo)本中，17例為肺炎支原體陽(yáng)性，陽(yáng)性率為5.90%。其中2月7例，3月4例，4月5例，5月1例，陽(yáng)性率分別為5.51%，11.4%，9.09%和1.41%。其中男性中檢測(cè)出MP陽(yáng)性6份，女性中檢測(cè)出MP陽(yáng)性11份。MP陽(yáng)性標(biāo)本在不同年齡組的分布為，<1歲為2例，1～2歲為3例，3～6歲為9例，7～13歲為3例，各年齡組的陽(yáng)性率分布為7.14%，3.66%，6.25%和8.82%。采集時(shí)間，患兒性別及年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表15種呼吸道常見(jiàn)致病菌檢測(cè)引物

Tab.1The primer sequences used for the bacteria detection

PrimersGeneSequence(5'-3')Length(bp)CP16SrRNACP-F1346TCCCCTTCTTTAATATATATTAG1368139CP-R1486TGACTTCGGTTGTTATTTAGTGGCG1460LP16SrRNALP-F808TTGGTTATATGAAAATAATTA82895LP-R902CCGTCAATTCATTTGAGTTT883TB16SrRNATB-F672GGTGTAGCGGTGGAATGCGC691140TB-R811CACCGTTTACGGCGTGGAC793PA16SrRNAPA-F1381GGGCCTTGTACACACCG1397128PA-R1508ACGGTTACCTTGTTACGACTT1488EC16SrRNAEC-F49TAACACATGCAAGTCG6471EC-R119TTACTCACCCGTCCGCC103

2.2肺炎支原體耐藥基因檢測(cè)結(jié)果17例肺炎支原體陽(yáng)性標(biāo)本中，15例存在大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因突變，突變率為88.2%，其中14例為A2063G突變，1例為A2063T的突變。

2.3呼吸道常見(jiàn)致病菌檢測(cè)結(jié)果除MP外，288例標(biāo)本中54例(18.8%)可檢測(cè)出其它呼吸道常見(jiàn)致病菌，構(gòu)成比分別為：KP為30.5%(18/59)，SA為20.3%(12/59)，PA為20.3%(12/59)，SE為15.3%(9/59)，HI為10.2%(6/59)，SP為5.08%(3/59)，LP為5.08%(3/59)，EC，CP，TB均為0例(0%)， KP，SA以及PA感染占主要地位。2月18例，3月18例，4月12例，5月6例，陽(yáng)性率分別為14.2%，51.4%，21.8%和8.45%。各月份細(xì)菌感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.5，P<0.05)，3月份明顯高于其他月份。存在細(xì)菌感染的男性為18例，女性為36例，陽(yáng)性率分別為10.8%和29.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.1，P<0.05)，女性高于男性。細(xì)菌感染在不同年齡組的分布為，<1歲為12例，1～2歲為15例，3～6歲為24例，7～13歲為3例，各年齡組的陽(yáng)性率分布為42.6%，18.3%，16.7%和8.82%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.3，P<0.05)，其中<1歲組高于其他年齡組。54例細(xì)菌感染標(biāo)本中，6例(11.1%)存在合并感染，其中KP+PA為3例，SA+HI+PA為3例。與MP感染綜合分析可知，肺炎支原體與細(xì)菌感染標(biāo)本共59例，陽(yáng)性率為20.5%。其中，10例(10/59，16.9%)存在合并感染的標(biāo)本中，除SA+HI+PA及KP+PA(均為3例)外，MP+KP為2例，MP+HI為1例，MP+PA為1例。2月3例，3月1例，4月2例，5月4例；男性中檢測(cè)出2例，女性中檢測(cè)出8例；在不同年齡組的分布為，<1歲為4例，1～2歲為0例，3～6歲為3例，7～13歲為3例，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(所有P值均>0.05)。

表2288例標(biāo)本合并感染情況

Tab.2Co-infection in the 288 specimens

Co-infectionTypesNumberTwoKP+PA3Mp+KP2Mp+HI1Mp+PA1ThreeSA+HI+PA3

3　討　論

肺炎支原體是社區(qū)獲得性呼吸道感染的重要致病菌之一，尤其是學(xué)齡前兒童和青壯年。兒童肺炎中10%～30%的病例是MP引起的，一年四季均有出現(xiàn)，但以冬春季發(fā)病為主。主要通過(guò)與患者的近距離接觸傳播，從接觸密切的親屬和社區(qū)開(kāi)始流行，每3～7年在不同地區(qū)出現(xiàn)MP流行高峰，在流行高峰年MP肺炎可高達(dá)30%～50%[2-3]。對(duì)家庭、學(xué)校、部隊(duì)、社會(huì)都會(huì)產(chǎn)生較大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)不良影響，應(yīng)該引起人們足夠的重視。研究資料顯示，無(wú)錫地區(qū)肺炎支原體感染率2004-2005年為27.0%[8]，2007年為27.11%，MP的感染率相對(duì)較高[9]。本研究中，MP的陽(yáng)性檢測(cè)率為5.90%，低于項(xiàng)紅霞等報(bào)道的無(wú)錫地區(qū)2008-2010年感染率[10]。我們之前的研究顯示[11]，2007年和2012年為MP的暴發(fā)流行年，而2015年2-5月為非流行期，因此，MP感染率相對(duì)較低。

2000年以來(lái)，世界各地均陸續(xù)出現(xiàn)了肺炎支原體耐藥的相關(guān)報(bào)道。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因檢出率不斷攀升，歐洲國(guó)家的耐藥率較低，小于10%[12]，美國(guó)也低于10%[13]，而日本耐藥率大于80%[14]，在中國(guó)耐藥率最高，達(dá)到了90%以上[15]，但關(guān)于無(wú)錫地區(qū)肺炎支原體臨床菌株耐藥性報(bào)道較少。本研究中，肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥基因突變率為88.2%，與北京，上海等地區(qū)的報(bào)道一致[15-16]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家[12-13]，在肺炎支原體治療用藥方面應(yīng)該引起足夠重視。

病毒是上呼吸道感染的主要病原，細(xì)菌是下呼吸道感染的主要病原，細(xì)菌感染率可高達(dá)55%。病原菌的分布特點(diǎn)與時(shí)間和地域差異關(guān)系密切，了解細(xì)菌分布，對(duì)于臨床診斷和治療均有重要意義，可避免抗生素的濫用和耐藥菌株的產(chǎn)生。目前，病原菌分離培養(yǎng)法為病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是目前臨床最常用的診斷方法，但分離培養(yǎng)耗時(shí)長(zhǎng)，受標(biāo)本采集、運(yùn)輸和培養(yǎng)條件的影響較大，且有些需特殊培養(yǎng)的常見(jiàn)細(xì)菌如SP、HI 的檢出率不高。

本研究中，下呼吸道感染患兒按年齡組分析，學(xué)齡前兒童(3～6歲)占比例最高(144例，50%)，其次為幼兒(38.2%)和學(xué)齡兒童(11.8%)，與2014年張昕婷等的結(jié)果一致[17]。

無(wú)錫地區(qū)下呼吸道感染病原菌中肺炎克雷伯桿菌最常見(jiàn)，其次為金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，未檢測(cè)出大腸埃希菌，肺炎衣原體及結(jié)核桿菌。與謝瑩瑩，梁卓夫等報(bào)道的以革蘭氏陰性菌為主相符[18]；與蘇州地區(qū)小兒下呼吸道感染以肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌為主的報(bào)道不同[19]。馮燕玲等報(bào)道北京地區(qū)兒童呼吸道感染的主要病原菌為SP，HI，SA，SE，KP，與本研究相符。細(xì)菌檢出率與患兒性別有關(guān)，女性高于男性，與蘇州地區(qū)等報(bào)道的結(jié)果一致。且本研究中細(xì)菌檢出率隨年齡增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)，<1歲組患兒陽(yáng)性檢出率最高，>7歲組兒童陽(yáng)性檢出率最低，與其他地區(qū)的報(bào)道一致[19]，可能是由于幼兒的器官及生理功能尚未發(fā)育健全，呼吸道粘膜脆弱，粘膜血流量少，且自身免疫功能也尚未發(fā)育完善。本研究中，存在混合感染的標(biāo)本為10例，占感染數(shù)的16.9%，高于之前的報(bào)道，最常見(jiàn)的合并感染為SA+HI+PA及KP+PA。以往研究中，關(guān)于肺炎支原體與病毒合并感染的報(bào)道較多，與細(xì)菌合并感染的報(bào)道較少，本研究中MP合并感染率為23.5%(4/17)，與Wujun Jiang等的報(bào)告比例(102/330，30.9%)類(lèi)似[20]，最容易與KP合并感染。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)2015年春季無(wú)錫地區(qū)兒童肺炎支原體及其他呼吸道常見(jiàn)致病菌的分析，肺炎支原體及其他呼吸道常見(jiàn)致病菌陽(yáng)性檢測(cè)率為20.5%，其中肺炎支原體及肺炎克雷伯桿菌為主要致病菌，女性及<1歲組，細(xì)菌感染較其他組常見(jiàn)。由于肺炎支原體感染與其它兒童常見(jiàn)病原菌感染治療方案有差異且肺炎支原體耐藥率較高，了解本地區(qū)肺炎支原體與其它病原菌分布情況，有助于臨床醫(yī)生快速診斷，合理用藥，從而縮短療程，降低治療費(fèi)用，避免濫用抗菌藥物，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。由于本研究標(biāo)本收集時(shí)間段較短，病例數(shù)較少，對(duì)肺炎支原體耐藥與臨床病情之間的關(guān)系尚不明確，有必要進(jìn)一步追蹤監(jiān)測(cè)。

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Distribution ofMycoplasmapneumoniaeand respiratory pathogens in the specimen collected from Wuxi in the spring of 2015

CHANG Qing1, YAN Chao2, YU Rong1, GAO Yan-min1, OU YANG Bing1, SUN Hong-mei2

(1.DepartmentofPediatrics,WuxiNo.8People’sHospitalGroup,Wuxi214016,China;2.DepartmentofBacteriology,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

We explored the distribution ofMycoplasmapneumoniaeand other respiratory pathogens in the specimens collected from children with respiratory infection in Wuxi. PCR was used to detectMycoplasmapneumoniaeand 10 respiratory pathogens, and nPCR-SSCP-CE was used to detect the mutations associated with macrolide resistance. Results showed that one or more pathogens were detected in 59 of 288 specimens, and the positive rate was 20.5%. The children <2 years old and the female were susceptible. Results indicated that 28.8% (17/59) wereMycoplasmapneumoniae, 30.5% (18/59) were KP, 20.3% (12/59) were SA, 20.3% (12/59) were PA, 15.3% (9/59) were SE, 10.2% (6/59) were HI, 5.08% (3/59) were SP, 5.08% (3/59) were LP, and EC, CP, TB were 0%, respectively. The mutation rate of macrolide associate resistance toMycoplasmapneumoniaewas 88.2%, and the co-infection were detected in 10 specimens.The most common pathogens wereMycoplasmapneumoniaeand Kp in Wuxi and there was a high rate of macrolide resistance.

Mycoplasmapneumoniae; microlide resistance; respiratory pathogens; pediatrics; Wuxi

Sun Hong-mei, Email: s.hongmei@263.net

孫紅妹，Email：s.hongmei@263.net

1.江蘇省無(wú)錫市第八人民醫(yī)院兒科，無(wú)錫214016；2.首都兒科研究所細(xì)菌研究室，北京100020

R375

A

1002-2694(2016)07-0636-05

2015-12-04；

2016-02-14

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.009

無(wú)錫市衛(wèi)生計(jì)生委婦幼健康科研項(xiàng)目(No.FYKY201505)