張長風(fēng)，于　魁，朱麗華，李淑英

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攜帶BARF1基因的重組巨細胞病毒的構(gòu)建

張長風(fēng)1，2，于魁2，朱麗華2，李淑英2

目的依據(jù)細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC)能夠克隆大段DNA病毒的特點，通過galk為基礎(chǔ)的同源重組，將EB病毒編碼BARF1基因插入巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV),構(gòu)建重組病毒。方法PCR擴增帶有巨細胞病毒UL57基因左右同源臂的galk及BARF1基因片段，經(jīng)過電轉(zhuǎn)化，進行同源重組，經(jīng)含有g(shù)alk培養(yǎng)基及脫galk培養(yǎng)基篩選，獲得帶有BARF1的巨細胞病毒細菌人工染色體克隆，提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染到ARPE-19細胞,觀察帶有BARF1基因的巨細胞病毒對ARPE-19細胞的影響。結(jié)果感染帶有BARF1基因的巨細胞病毒的ARPE-19細胞形態(tài)由原來的長梭形變?yōu)樽儓A、腫脹、胞漿顆粒增多，并且細胞生長失去接觸抑制，出現(xiàn)重疊生長現(xiàn)象。結(jié)論建立了攜帶BARF1基因的重組巨細胞病毒;同時表明利用細菌人工染色體,可方便地對病毒基因組進行準(zhǔn)確操作。

同源重組；電轉(zhuǎn)化；細菌人工染色體

細菌人工染色體(bacterial artificial chromosome，BAC)的發(fā)展，是DNA病毒基因結(jié)構(gòu)、功能及疫苗研究領(lǐng)域的一項重大突破。利用細菌人工染色體進行克隆，病毒能夠在細菌細胞內(nèi)穩(wěn)定傳播，也能在細菌細胞內(nèi)進行同源重組；并且病毒細菌人工染色體中，任何要求的基因重組或突變，都能夠迅速容易地實現(xiàn)，這種基因改變能在病毒重組前加以驗證，因此，細菌人工染色體的建立為重組病毒的構(gòu)建、病毒基因功能的研究帶來了極大的方便[1-5]。本項研究利用人巨細胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)的細菌人工染色體能夠克隆大段DNA病毒的特點，通過以galk為基礎(chǔ)的同源重組，將EB病毒編碼BARF1基因插入HCMV,構(gòu)建重組病毒。為進一步探討病毒基因結(jié)構(gòu)、功能和新型疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1　材　料

1.2質(zhì)粒pgalk和pBARF1質(zhì)粒,巨細胞病毒細菌人工染色體是一種對人無致病作用的巨細胞病毒株的細菌人工染色體(Towne bacterial artificial chromosome system，T-BAC)，含有巨細胞病毒的全部基因組及氯霉素抗性基因；都為本室保存。

1.31×M9培養(yǎng)基(1 L)將Na2HPO4(6 g)、KH2PO4(3 g)、NH4Cl(1 g)和NaCl(0.5 g)溶解于1 L 雙蒸水中，高壓滅菌備用。1.4M63培養(yǎng)基(5×M63)將(NH4)2SO4(10 g)、KH2PO4(68 g)和FeSO4·7H2O(2.5 mg)溶解于1 L雙蒸水中，用KOH 調(diào)節(jié)pH=7，高壓滅菌備用。

1.5用M63配制galk培養(yǎng)板1) 取7.5 g瓊脂于400 mL 雙蒸水中，高壓滅菌備用；2) 添加 100 mL已經(jīng)高壓滅菌的5×M63培養(yǎng)液和0.5 mL 1 mol/L MgSO4·7 H2O ；3) 在 50 ℃ 水浴冷卻至50 ℃，添加5 mL 20%無菌半乳糖，2.5 mL無菌D-生物素(0.2 mg/mL), 2.25 mL 無菌L-亮氨酸(10 mg/mL), 500 μL無菌氯霉素 (12.5 mg/mL)；4) 混勻倒平板(每塊平板大約25 mL)。

1.6用M63制備脫galk培養(yǎng)板將上述2.5制備培養(yǎng)基中的5 mL 20%無菌半乳糖，更換為5 mL 20%無菌2-脫氧-D-半乳糖，此外，添加2.0 mL 50%無菌甘油, 混勻倒平板即可。

2　操作步驟

2.1SW102電感受態(tài)細胞的制備常規(guī)方法制備SW102電轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞，-80 ℃保存。

2.2制備含有巨細胞病毒細菌人工染色體(T-BAC)的SW102細胞將T-BAC質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)到SW102電感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)移到1 mL LB培養(yǎng)液，32 ℃孵育1 h；離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，涂布于含有氯霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基，32 ℃ 培養(yǎng)1 d后，有克隆形成，挑選4個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(用巨細胞病毒開放讀碼框UL57引物：Forward: 5′-agacgtcgtgcgtcaaacat-3′；Reverse: 5′-Aacggtcgcataacgagaga-3′產(chǎn)物210 bp)鑒定。并將其命名為SW102-T-BAC。制備SW102-T-BAC電感受態(tài)細胞，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3PCR擴增帶有巨細胞病毒開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因依據(jù)GenBank提供的Towne.基因序列(FJ616285.1)，設(shè)計帶有巨細胞病毒開放讀碼框UL57左右同源臂的galk引物：Galk-Forward，GtataaaattcactcagtggcggcgtagccattgtcttccgttcatccaccatgCCTGTTGACAATTAA-TCATCGGCA；Reverse，Gagaaaagccgcgggccccaccggcgctagcgcggttagttcctcgtggct TCAGCACTGTCCTGCTCCTT，產(chǎn)物約1 400 bp。以pgalk質(zhì)粒DNA為模板，用所設(shè)計galk引物，PCR擴增帶有巨細胞病毒開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，回收純化。

2.4Galk基因插入帶巨細胞病毒開放讀碼框UL57將已純化帶有巨細胞病毒開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因電轉(zhuǎn)到SW102-T-BAC感受態(tài)細胞，然后轉(zhuǎn)移到含有1 mL LB 的培養(yǎng)液，在32 ℃搖床孵育1 h，離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，取沉淀涂布于步驟2.5中用M63配制的galk培養(yǎng)板，32 ℃培養(yǎng)3 d后有克隆形成；挑選3個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(所用引物：Forward: 5′-agacgtcgtgcgtcaaacat-3′；Reverse: 5′-Aacggtcgcataacgagaga-3′，產(chǎn)物1 400 bp)檢測galk。將其命名為SW102-T-galk-BAC。制備SW102-T-galK-BAC感受態(tài)細胞。

2.5用BARF1代替galk基因可為任何感興趣的基因突變, 在這里我們用BARF1標(biāo)記Towne的UL57，即BARF1基因。

2.3 病例診治和上報情況 2007-2017年，全市醫(yī)療機構(gòu)診斷報告瘧疾病例6 167例，其中實驗室確診病例5 545例，占89.91%，臨床診斷病例614例，占9.96%，疑似病例6例，占0.10%，帶蟲者2例，占0.03%。消除瘧疾行動計劃實施后規(guī)范了瘧疾診斷報告，2012年之后均為實驗室確診病例。其中，綜合醫(yī)院報告1 198例，占19.43%，疾控中心報告2 727例，占44.22%，衛(wèi)生院報告2 190例，占35.51%，民營醫(yī)院及其他報告52例，占0.84%。病例診斷后24 h內(nèi)報告6 096例，報告及時率98.85%。

2.5.1PCR擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的BARF1依據(jù)GenBank提供的EB病毒基因序列(NC_009334)，設(shè)計引物：BARF1-Forward: 5′-Gtataaaattcactcagtggcggcgtagccattgtc-ttccgttcatccaccatg atggccaggttcatcgctcag-3′BARF1-Reverse: 5′-Gagaaaagccgcgggccccaccggcgctagcgcg-gttagttcctcgtggct ttattgcgacaagtatccag-3′，產(chǎn)物771 bp，以pBARF1質(zhì)粒為模板，用所設(shè)計引物PCR擴增BARF1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳后，切膠，回收純化。

2.5.2基因BARF1替代galk取上述純化PCR產(chǎn)物與SW102-T-galk-BAC感受態(tài)細胞混合，電轉(zhuǎn)化，然后轉(zhuǎn)移到含有1 mL LB的培養(yǎng)液，在32 ℃搖床孵育4.5 h(可通過這樣長時間孵育，獲得重組基因BARF1的質(zhì)粒，使其他不需要質(zhì)粒丟失)，離心，用1×M9液洗滌沉淀2次，將沉淀混懸于1 mL M9培養(yǎng)液中,取100 μL,再分別進行10倍及100倍稀釋后涂布于步驟2.6中用M63配制的脫galk培養(yǎng)板，32 ℃培養(yǎng)3 d后有克隆形成；挑選3個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR(所用引物：Forward: 5′-agacgtcgtgcgtcaaacat-3′；Reverse: 5′-Aacggtcgcataacgagaga-3′，產(chǎn)物876 bp)檢測BARF1基因。將其命名為SW102-T-BARF1-BAC。

2.6轉(zhuǎn)染接種ARPE-19細胞于6孔反應(yīng)板，置于5% CO2的37 ℃溫箱中培養(yǎng)，待其生長到匯合度約為60%時，分別用SW102-T-BAC和SW102-T-BARF1-BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。1)取4.5 μg大提質(zhì)粒，用無血清的DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋至150 μL。2)取18 μL轉(zhuǎn)染試劑，用無血清的DMEM細胞培養(yǎng)液稀釋至300 μL。3)將二者混合均勻，室溫放置20 min。4)SW102-T-BAC的混合物添加到6孔板(分別標(biāo)記1,2,3,4,5,6)的1,2孔細胞，3,4孔細胞添加SW102-T-BARF1-BAC,5,6孔為原來的細胞作對照。5)24 h后更換細胞培養(yǎng)液；然后每2～3 d換1次細胞培養(yǎng)液；每天顯微鏡下觀察細胞生長狀況。待細胞長滿六孔板后,更換到10 cm培養(yǎng)皿培養(yǎng)，繼續(xù)觀察。2.7轉(zhuǎn)染細胞中基因BARF1表達的檢測待10 cm培養(yǎng)皿的細胞長滿后，收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細胞，分別提取細胞的蛋白，用Western blot檢測BARF1蛋白的表達。

3　結(jié)　果

3.1SW102-T-BAC的檢測將T-BAC DNA電轉(zhuǎn)到SW102感受態(tài)細胞，從含有氯霉素(12.5 mg/mL)LB瓊脂平板中，挑選3個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR擴增后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測到大小為210 bp的產(chǎn)物，圖1中：1是以無菌水為模板的陰性對照；2-4分別是以挑選的3個克隆所提取質(zhì)粒DNA為模板的PCR擴增后產(chǎn)物，結(jié)果表明與預(yù)期的結(jié)果相一致，說明所挑選克隆是正確的。將其命名為SW102-T-BAC。

3.2PCR擴增帶有巨細胞病毒開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因以質(zhì)粒pgalk為模板，PCR 擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因片段，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察到大約1 400 bp的產(chǎn)物，圖2中：3是陰性對照；1與2分別是PCR擴增的帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因，所得片段大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明所擴增片段正確。

圖1　PCR檢測SW102-T-BAC克隆Fig.1　Detection of SW102-T-BAC clones by PCR

圖2　PCR擴增galk基因片段Fig.2　Galk gene amplified by PCR

圖3　克隆galk基因至SW102-T-BAC的檢測Fig.3　Detection of galk from SW102-T-galk-BAC

3.3克隆galk基因至SW102-T-BAC將所擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的galk基因片段電轉(zhuǎn)到SW102-T-BAC感受態(tài)細胞，經(jīng)氯霉素抗性篩選3 d后，挑選5個克隆，提取其質(zhì)粒DNA，PCR 擴增后，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察到大約1 400 bp的產(chǎn)物，圖3中：6為陰性對照；1-5分別是帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的galk片段電轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞后，經(jīng)抗性篩選，所挑選5個克隆提取其質(zhì)粒DNA后，PCR 檢測的結(jié)果，所得片段大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明galk已克隆至SW102-T-BAC。將其命名為SW102-T-galk-BAC。

3.4PCR擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的BARF1基因以質(zhì)粒pBARF1為模板，PCR 擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的BARF1基因片段，經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳觀察到大約771 bp的產(chǎn)物，圖4中：5為陰性對照；1-4分別是PCR擴增帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的BARF1基因，所得片段大小與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明所擴增片段正確。

圖4　PCR擴增BARF1基因Fig.4　BARF1 gene amplified by PCR

圖5　BARF1基因代替galk突變的檢測Fig.5　Detection of BARF1 instead of galK mutation

圖7　Western blot鑒定BARF1的表達狀況Fig.7　Detection of BARF1 by western blot

3.5基因BARF1替代galk將已純化帶有帶有Towne開放讀碼框UL57左右同源臂的BARF1基因片段電轉(zhuǎn)到SW102-T-galk-BAC感受態(tài)細胞后，涂布于M63配制的脫galk培養(yǎng)板中，經(jīng)氯霉素抗性基因篩選，32 ℃培養(yǎng)3 d后有克隆形成；挑選4個克隆，提取質(zhì)粒DNA，PCR檢測BARF1基因，所得產(chǎn)物大小876 bp，圖5中：5為陰性對照；1-4 分別是BARF1基因脫galk后挑選的4個克隆，質(zhì)粒提取后PCR檢測的結(jié)果，與預(yù)期的結(jié)果相一致，表明BARF1基因代替了galk，測序結(jié)果正確。將其命名為SW102-T-BARF1-BAC。

3.6轉(zhuǎn)染分別將SW102-T-BAC和SW102-T-BARF1-BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)染ARPE-19細胞，顯微鏡下觀察：被病毒感染的細胞的形態(tài)逐漸發(fā)生改變，隨著時間的延長，細胞形態(tài)改變越來越明顯，大約培養(yǎng)20 d，被轉(zhuǎn)染細胞和未轉(zhuǎn)染細胞相比：轉(zhuǎn)染攜帶BARF1基因的巨細胞病毒的細胞形態(tài)由原來的長梭形變?yōu)樽儓@、腫脹、胞漿顆粒增多，細胞相互間的走向失去正常規(guī)律性，細胞失去接觸抑制現(xiàn)象，并且重疊生長，出現(xiàn)了腫瘤細胞生長的特點(圖6A，6B，6C)。

圖6A　未轉(zhuǎn)染的ARPE-19細胞Fig.6A　Non-transfected ARPE-19 cells

圖6B　轉(zhuǎn)染SW102-T-BAC的ARPE-19細胞Fig.6B　ARPE-19 cells of transfected SW102-T-BAC

圖6C　轉(zhuǎn)染SW102-T-BARF1-BAC的細胞Fig.6C　ARPE-19 cells of transfected SW102-T-BARF1-BAC

3.7病毒轉(zhuǎn)染細胞后BARF1表達狀況的檢測分別收集轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染的細胞，分別提取細胞的蛋白，用Western blot檢測BARF1蛋白的表達。結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染SW102-T-BAC細胞提取蛋白的結(jié)果都為陰性；陽性對照B95-8細胞與轉(zhuǎn)染SW102-T-BARF1-BAC細胞提取蛋白后，Western blot結(jié)果都得到約為31 kD的產(chǎn)物，圖7中：1-4分別是從未轉(zhuǎn)染細胞中提取蛋白、從轉(zhuǎn)染SW102-T-BAC 的細胞中提取蛋白、從 B95-8 細胞中提取蛋白及從轉(zhuǎn)染SW102-T-BARF1-BAC細胞中提取蛋白后，Western blot檢測BARF1的結(jié)果；表明攜帶BARF1基因的重組巨細胞病毒構(gòu)建成功。

4　討　論

Towne病毒株是經(jīng)過HCMV反復(fù)感染細胞后分離得到的，該病毒株已失去人體內(nèi)復(fù)制與擴散的能力，不具有致病性，但在體外細胞培養(yǎng)過程中仍能生長繁殖，該病毒株是試驗研究最常用病毒株，其基因組為240 kb的雙鏈DNA病毒，包括166個開放讀碼框(open reading frame，ORF)，由于基因組巨大這一特點，傳統(tǒng)分子克隆技術(shù)很難對其基因加以改造。但近年來，隨著CMV細菌人工染色體的構(gòu)建，CMV-BAC允許CMV基因組中的目標(biāo)基因快速、高效突變，并形成CMV定向表達異源抗原[6,7]。BAC克隆的病毒可以在細菌細胞內(nèi)保持穩(wěn)定及傳播，并可容易地操作病毒基因組，任何要求的重組都可以在細菌細胞內(nèi)輕松、快速地完成[8-11]。為病毒基因結(jié)構(gòu)、功能的研究及其疫苗的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

SW102株是通過改良DY380而構(gòu)建的大腸桿菌細胞株[12-14]，是半乳糖操縱子中的半乳糖(galk)基因缺陷株。當(dāng)SW102株培養(yǎng)在半乳糖為唯一碳源的培養(yǎng)基時，需添加galk才能生長。在這種情況下，它取代了感興趣的基因，galk可以補充有缺陷的細菌galk基因,在含有半乳糖的培養(yǎng)基中成長。當(dāng)病毒細菌人工人色體中的galk被BARF1基因所取代時，利用含有g(shù)alk任何克隆的反選原則,在培養(yǎng)基中添加2-脫氧半乳糖進行負選擇，這樣可以通過反選，將BARF1基因選擇出來。這樣以galk為基礎(chǔ)，能夠高度特異、有效地進行BARF1基因(或其他感興趣基因)重組。

BARF1是EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV) 編碼的致癌基因，在EBV陽性腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能起重要作用[15-16]。本項研究結(jié)果顯示：利用人巨細胞病毒細菌人工染色體，通過 galk為基礎(chǔ)的選擇與反選，獲得了攜帶EB病毒編碼BARF1基因的重組人巨細胞病毒，并且該重組病毒轉(zhuǎn)染ARPE-19細胞后，表現(xiàn)出腫瘤細胞生長的特點，表明通過BARF1基因可克隆至人巨細胞病毒，使人巨細胞病毒進行定向突變產(chǎn)生有感染性的子代病毒，進而研究該突變病毒對表型的影響。

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Construction of the recombinant cytomegalovirus carryingBARF1 gene

ZHANG Chang-feng1，2, YU Kui2, ZHU Li-hua2, LI Shu-ying2

(1.InstituteofMedicalBiotechnology,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100050,China;2.SchoolofBasicMedicalSciences,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology/HebeiKeyLaboratoryforChronicDiseases，TangshanKeyLaboratoryforPreclinicalandBasicResearchonChronicDiseases,Tangshan063000,China)

The purpose of this study is to establish recombinant cytomegalovirus carryingBARF1 gene, which based on characteristics of bacterial artificial chromosome can clone a large segment DNA virus through homologous recombination on basis of galk. Galk andBARF1 gene fragment with 50 bp homologous arms of cytomegalovirus UL57 was amplified by PCR, respectively. The clones of recombinant cytomegalovirus carryingBARF1 gene was obtained after electroporation through homologous recombination and selection in medium containing galk and replacing galk forBARF1 gene in 2-deoxy-galactose medium. The plasmids of recombinant cytomegalovirus bacterial artificial chromosome containing BARF1 were transfected into ARPE-19 cells after the plasmids extracted from clones. The morphology of cells infected recombinant virus was changed from the original long fusiform to round, swelling, and full of cytoplasm particles. The cells of infected recombinant virus grow overlapping and lost contact inhibition. These results indicated that recombinant cytomegalovirus carryingBARF1 gene was established, and the virus genome can be operated accurately using bacterial artificial chromosomes.

homologous recombination; electroporation; bacterial artificial chromosome (BAC)

Supported by the Project of Science and Technology for Overseas Scholars of Hebei Province (No. C201400559)

Li Shu-ying, Email: lsy5001@sina.com

李淑英,Email:lsy5001@sina.com

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京100050；2.華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(河北省慢性疾病重點實驗室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點實驗室)，唐山063000

R373.1

A

1002-2694(2016)07-0595-05

2015-11-02；

2016-05-26

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.001

河北省留學(xué)人員科技活動資助項目(No.C20140059)