富 瑤 王 琦 楊 宇 鄭 江 胡曉靜 楊洪英

(1.遼寧出入境檢驗檢疫局；2.東北大學材料與冶金學院)

毒砂和含砷金精礦對某浸礦細菌胞外多糖含量的影響*

富 瑤1王 琦1楊 宇1鄭 江1胡曉靜1楊洪英2

(1.遼寧出入境檢驗檢疫局；2.東北大學材料與冶金學院)

浸礦細菌的胞外聚合層(EPS)作為菌體的保護層，同時也攜帶著細菌氧化硫化物的本質(zhì)信息，對硫化物的吸附和氧化反應(yīng)的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵的樞紐作用。為研究不同礦漿濃度體系的含砷礦物在氧化過程中，浸礦細菌胞外聚合層中多糖含量的變化，進行毒砂和含砷金精礦影響試驗。結(jié)果表明，毒砂礦漿濃度1.5%體系的細菌胞外聚合層中多糖含量最高分別可達1.0%和0.5%體系的1.39，1.61倍；含砷金精礦與胞外多糖相互作用過程中，當?shù)V漿中As(Ⅲ)向As(Ⅴ)快速轉(zhuǎn)化時，菌體可通過消耗胞外多糖來抵御砷離子的毒害；胞外多糖的C=C鍵、C-H鍵和=C-H 鍵可與砷甲基化，從而解除砷害，而其紅外吸收峰也因此發(fā)生偏移。試驗結(jié)果可為探索細菌氧化含砷難處理金礦的作用機制提供技術(shù)支持。

浸礦細菌 胞外聚合層 多糖 氧化

含砷難處理金礦是我國開發(fā)的有價礦產(chǎn)資源之一，這類礦石中的金被毒砂、黃鐵礦等硫化礦物包裹，直接氰化浸出率很低[1]。采用細菌氧化法預處理含砷金礦能耗少且環(huán)境友好[2-7]，該過程中由于硫化物分解，礦物中的砷氧化后以三價或五價的形式進入浸出液，浸礦細菌因被砷脅迫而采取應(yīng)激策略，胞外聚合層(Extracellular Polymers，簡稱EPS)也隨之變化調(diào)整。細菌胞外聚合層作為細菌氧化硫化物的反應(yīng)發(fā)生場所，不僅是菌體的保護層，還是細菌氧化硫化物本質(zhì)信息的攜帶者[8]，對硫化物的吸附和氧化反應(yīng)的調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵的樞紐作用，其與硫化物氧化活性的關(guān)系已成為國際細菌冶金領(lǐng)域的研究熱點。

論文以細菌胞外聚合層中多糖與砷的關(guān)系為切入點，研究細菌氧化毒砂、含砷金精礦過程中，砷脅迫狀態(tài)下細菌胞外聚合層中多糖的變化。從含砷單礦物到復合礦物，逐步探討細菌胞外聚合層的抗砷行為，為進一步研究細菌胞外聚合層的抗砷機理提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 含砷礦物、菌種與試驗設(shè)計

1.1 含砷礦物與菌種

含砷礦物：①毒砂，試驗所用的天然毒砂購于中國地質(zhì)博物館，磨礦細度-0.038 mm 90%以上；②含砷金精礦，試驗所用的金精礦礦樣取自湖南某高砷礦，含金129.1 g/t，含硫17.70%，含砷15.35%，磨礦細度-0.038 mm 90%以上。

試驗所用菌種為HQ0211菌，該細菌是高效浸礦混合菌株，由主體菌氧化亞鐵硫桿菌和氧化硫硫桿菌及氧化亞鐵微螺菌組成，它們以Fe2+、S為能源，在pH=1.0～2.5、中溫條件下化能自養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 細菌氧化含砷礦物

將同批活化至生長穩(wěn)定期的HQ0211菌液分裝于6個500 mL的三角瓶中，每瓶各200 mL；分別加入毒砂和金精礦至礦漿濃度為0.5%、1.0%、1.5%，用1∶1硫酸調(diào)節(jié)至pH=1.60，置于44 ℃、190 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 胞外聚合層中多糖的提取

礦漿中菌液胞外多糖的提取采用EDTA浸提離心法[9]：取3.0 mL 礦漿上清液于離心管中，在11 500 r/min的條件下常溫離心12 min，收集沉淀；沉淀中加入3.0 mL、3%的EDTA溶液，混勻，在11 500 r/min的條件下常溫離心12 min，上清液用孔徑0.45 μm的微孔濾膜過濾，濾液為待測的多糖樣品。

1.2.3 測定指標

細菌生長菌數(shù)采用血球計數(shù)板計數(shù)，砷含量采用次亞磷酸鹽滴定法測定[10]，多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[11]，多糖化學鍵的結(jié)構(gòu)分析采用Spectrum One紅外光譜儀掃描，固體樣品采用KBr壓片。

2 試驗結(jié)果與討論

2.1 毒砂的影響

2.1.1 對As(Ⅲ) 和As(Ⅴ)濃度的影響

細菌氧化毒砂過程中As(Ⅲ) 和As(Ⅴ)濃度隨時間變化的曲線見圖1。

圖1 毒砂氧化過程中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)濃度的變化

由圖1可知，第0～2 d內(nèi)，As(Ⅲ)迅速從礦物中氧化出來，礦漿濃度0.5%、1.0%、1.5%體系的As(Ⅲ)濃度最高分別可達0.4，0.78，1.15 g/L；此后As(Ⅲ)逐漸被氧化成As(Ⅴ)，即As(Ⅲ)濃度降低，As(Ⅴ)濃度增高；16 d時礦漿濃度0.5%、1.0%、1.5%體系的As(Ⅴ)濃度分別可達0.34,0.58,0.23 g/L。

2.1.2 對細菌生長和胞外聚合層中多糖含量的影響

毒砂氧化過程中細菌生長曲線見圖2，細菌胞外聚合層中多糖含量的變化曲線見圖3。

圖2 毒砂氧化過程中細菌生長曲線

圖3 細菌胞外聚合層中多糖含量的變化

由圖2并結(jié)合圖1砷離子變化趨勢可知，加入毒砂0～2 d內(nèi)，由于細菌對毒砂的吸附以及毒砂釋放的砷離子對細菌的毒害，使得體系中細菌數(shù)量快速下降，下降幅度達62.41%以上，且礦漿濃度越高，菌數(shù)減少越多；之后由于細菌氧化毒砂中的亞鐵和硫元素獲得能量用于自身繁殖，礦漿濃度0.5%、1.0%體系中的細菌分別在2～8 d和2～10 d時處于對數(shù)生長期，菌數(shù)最高分別為2.80×107，2.97×107mL，而由于高濃度毒砂的抑制作用，礦漿濃度1.5%的體系中細菌僅在4～6 d內(nèi)呈現(xiàn)對數(shù)生長，且菌數(shù)始終低于較低礦漿濃度的體系，最高僅1.27×107mL。

由圖3分析可知，加入毒砂0～6 d 內(nèi)，礦漿濃度0.5%、1.0%的體系中細菌胞外聚合層中多糖含量一直低于0 d時初始多糖的含量；6～10 d，多糖含量迅速升高，此后含量下降；礦漿濃度1.5%的體系中多糖含量在2～12 d內(nèi)持續(xù)上升，之后降低。毒砂氧化過程中，3種礦漿濃度的細菌胞外多糖含量為1.5%體系>1.0%體系>0.5%體系，且1.5%體系多糖含量最高時分別為1.0%、0.5%體系的1.39倍、1.61倍。綜合分析毒砂氧化過程中砷離子、菌數(shù)和多糖含量的變化，發(fā)現(xiàn)多糖含量的變化與砷離子濃度和細菌生長周期的變化密切相關(guān)：砷離子尤其是As(Ⅲ)濃度增高可刺激細菌胞外多糖的產(chǎn)生，且這種現(xiàn)象在細菌的對數(shù)生長期尤為明顯。

2.2 含砷金精礦的影響

2.2.1 對As(Ⅲ)和As(Ⅴ)濃度的影響

含砷金精礦氧化過程中As(Ⅲ)和As(Ⅴ)濃度的變化見圖4。

圖4 含砷金精礦氧化過程中As(Ⅲ)、As(Ⅴ)濃度的變化

從圖4可以看出，金精礦氧化過程中，礦漿濃度分別為0.5%、1.0%、1.5%體系的As(Ⅲ)濃度在第1 d時積累到最高，分別為0.26,0.42,0.73 g/L；第1～4 d，As(Ⅲ)被迅速氧化成As(Ⅴ)，體系中As(Ⅲ)濃度明顯下降，As(Ⅴ) 濃度快速上升；第4～8 d，As(Ⅲ)氧化速度減緩，As(Ⅴ)濃度也趨于恒定。

2.2.2 對細菌生長和胞外聚合層中多糖含量的影響

金精礦氧化過程中細菌生產(chǎn)曲線見圖5，細菌胞外聚合層中多糖含量的變化見圖6。

從圖5可以看出含砷金精礦氧化過程中細菌的繁殖行為。加入金精礦的0～1 d，細菌需要適應(yīng)加入礦物后的新環(huán)境，處于生長延滯期，菌數(shù)無明顯變化。由斜率大小可以看出，礦漿濃度為0.5%的體系中，細菌對數(shù)生長期為1 d，而礦漿濃度為1.0%和1.5%的體系中，細菌的對數(shù)生長期為2 d。原因是礦漿濃度提高，細菌可利用的營養(yǎng)物質(zhì)增多，細菌的對數(shù)生長期延長。對數(shù)生長期結(jié)束后，各個礦漿濃度體系中的細菌均進入為期4 d的穩(wěn)定生長期，之后進入衰亡期。

圖5 含砷金精礦氧化過程中細菌生長曲線

圖6 細菌胞外聚合層中多糖含量的變化

從圖6并結(jié)合體系中砷離子的變化趨勢可以看出，加入金精礦的0～1 d，體系A(chǔ)s(Ⅲ)濃度急劇增多時，細菌產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，分泌的多糖溶解到溶液中，通過多糖與金屬離子的結(jié)合，降低細胞周圍環(huán)境中有害離子的含量，從而限制有害離子的跨膜吸收，避免細胞受到侵害；第1～4 d ，As(Ⅲ) 被快速氧化為As(Ⅴ)，體系中As(Ⅲ)濃度降低，總砷毒性降低，且細菌處于對數(shù)生長期，菌數(shù)增多，多糖得到積累，含量增高；第4～6 d，體系中各項指標穩(wěn)定，細菌適應(yīng)該環(huán)境，產(chǎn)生的多糖減少，大部分多糖又吸附到礦物表面，參與礦物氧化反應(yīng)，降低細菌胞外聚合層中的多糖含量。

2.3 多糖的紅外光譜分析

分別提取活化至生長穩(wěn)定期的HQ0211菌液和1.0%的毒砂和金精礦體系中的多糖，紅外光譜分析其化學鍵，結(jié)果見圖7。

圖7 多糖的紅外光譜分析結(jié)果

從圖7可以發(fā)現(xiàn)，各體系中細菌胞外聚合層中多糖均含有波長1 633 cm左右的伸縮振動C=C鍵、波長1 405 cm左右的彎曲振動的C-H鍵和波長1 000-700 cm彎曲振動的=C-H鍵；不同體系中多糖的各個化學鍵的波長均有偏移，且金精礦礦漿體系中C=C鍵的波長變小，而=C-H鍵的波長偏移幅度較大。推測這種偏移現(xiàn)象產(chǎn)生的原因是含砷礦樣中的多糖與礦漿中的砷離子結(jié)合。

綜合分析毒砂、含砷金精礦被細菌氧化過程中砷離子、菌數(shù)、細菌胞外聚合層中多糖含量的變化，可以發(fā)現(xiàn)：金精礦含砷量低于毒砂，胞外多糖對砷離子的抵御作用表現(xiàn)得更為明顯；在砷脅迫狀態(tài)下，HQ0211菌為化能自養(yǎng)型細菌或異養(yǎng)型砷氧化微生物，對砷的氧化過程是一種自身的解毒機制，即通過將As(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為毒性較低的As(Ⅴ)來降低砷對細胞的毒性[12-14]；這種解毒機制需要有機物質(zhì)作為底物和能量，胞外聚合層中的多糖正是這種物質(zhì)。

3 結(jié) 論

(1)毒砂和含砷金精礦在HQ0211細菌氧化過程中，不同礦漿濃度體系中As(Ⅲ)濃度提高會刺激細菌胞外聚合層中多糖的產(chǎn)生，當?shù)V漿中As(Ⅲ)向As(Ⅴ)快速轉(zhuǎn)化時，其中的多糖含量也隨之增加，該現(xiàn)象在細菌對數(shù)生長期尤為明顯。

(2)砷脅迫狀態(tài)下，細菌胞外聚合層中多糖的主體結(jié)構(gòu)沒有改變，但其C=C鍵、C-H鍵和=C-H 鍵的紅外吸收峰發(fā)生偏移。

(3)HQ0211菌可提高其胞外聚合層中多糖的含量來抵御砷離子的毒害，多糖含量的升高有兩個作用：一是多糖可以協(xié)助細胞膜阻截砷離子的侵入；二是多糖與砷離子之間可通過化學鍵的結(jié)合來完成菌體自身的解毒過程。

[1] 佟琳琳，姜茂發(fā)，楊洪英，等.湖南某高砷難處理金精礦的細菌氧化-氰化提金實驗研究[J].貴金屬，2008，29(1):15-18.

[2] Henry L Ehrlich.Past，present and future of biohydrometallurgy[J].Hydrometallurgy,2001,59(2-3):127-134.

[3] Akcil A.Potential bioleaching developments towards commercial reality:Turkishmetalmining's future[J].Minerals Engineering,2004,17(3):477-480.

[4] Cabral T,Ignatiadis I.Mechanistic study of the pyrite solution interface during the oxidative bacterialdissolution of pyrite(FeS2)by using electrochemical techniques[J].International Journal of Mineral Processing,2001,62(1-4):41-64.

[5] Tipre D R,Dave S R.Bioleachingprocess for Cu-Pb-Zn bulk concentrateat high pulp density[J].Hydrometallurgy,2004，75(1-4):37-43.

[6] Watling H R.The bioleaching of sulphide mineralswith emphasis on coppersulphides-A review[J].Hydrometallurgy,2006,84(1-2):81-108.

[7] 訾建威，楊洪英，鞏恩普，等.細菌氧化預處理含砷難處理金礦的研究進展[J].貴金屬，2005，26(1)：66-70.

[8] Arredondo R,A Garcia A,Jerez CA.Partial removal of lipolysaccharide from Thiobacillus ferrooxidans relevant to adhesion on mineral surfaces[J].Environ.Microbiol,1994(60):109-116.

[9] 東北大學.一種提取細菌胞外聚合層中多糖的方法：中國，200910010238.1[P].2009-07-15.

[10] 孫淑媛,孫齡高,殷齊西，等.礦石及有色金屬分析手冊[M].北京:冶金工業(yè)出版社,1990.

[11] 富 瑤，楊洪英，范有靜，等.浸礦細菌胞外聚合層中多糖含量的測定[J].中南大學學報：自然科學版,2010,41(5)：1686-1690.

[12] Jon R.Lloyd,Ronald S.Oremland.Microbial Transformations of Arsenic in the Environment:From Soda Lakes to Aquifers[J].Elements,2006,2(2):85-90.

[13] Ronald S.Oremland,John F.Stolz.Arsenic,Microbes and Contaminated Aquifers[J].Trends in Microbiology,2005,13(2):45-49.

[14] Ronald S.Oremland,John F Stolz.The Ecology of Arsenic[J].Science,2003,300(5):939-944.

Influence of Arsenopyrite and Arsenic-bearing Gold Mineral on Variation of Polysaccharide in Extracellular Polymers of Leaching Bacteria Stress

Fu Yao1Wang Qi1Yang Yu1Zheng Jiang1Hu Xiaojing1Yang Hongying2

(1.Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau；2.College of Materials Science and Metallurgy, Northeastern University)

Extracellular Polymeric Substances (EPS) is protective layer of leaching bacteria, also carry the essence information of bacteria oxidate sulphide minerals, has key role in regulation of the adsorption and oxidation reaction on sulfide minerals. To investigate the change of extracellular polysaccharide content in the aggregation layer in oxidation process of different pulp density of arsenic minerals, carried out arsenopyrite and arsenic gold ore concentrate impact experiment. Results indicated that, polysaccharide content in the aggregation layer bacterial extracellular system can be as high as 1.39 times and 1.61 times of 1.0% and 0.5% system with arsenopyrite pulp density 1.5% system; During the interaction of arsenic-bearing gold oncentrate with extracellular polysaccharide, when As(Ⅲ) was transformed to As(Ⅴ) quickly, the bacteria can through the consumption of extracellular polysaccharide to resist the poison of arsenic ion; C=C bond, C-H bond and =C-H bond of the extracellular polysaccharide were methylated to remove arsenic evil and their IR offset under the arsenic stress. The results can provide technique basis for exploring bacterial oxidation mechanism of action of arsenic refractory gold ore.

Leaching bacteria, extracellular polymeric substances, Polysaccharide, Oxidation

*質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項“分類定級標準樣品溯源性基礎(chǔ)理論及技術(shù)研究”(編號：201310230)；大連市標準化資助獎勵項目(編號：DLBZH-ZJ2015-12044)。

楊洪英(1960—)，女，教授，博士研究生導師，110819 遼寧省沈陽市和平區(qū)文化路三巷11號。

2016-11-17)

富 瑤(1982—)，女，工程師 ，博士，116001 遼寧省大連市中山區(qū)長江東路60號。