陳　晶，梁麗英，宋　曦

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物實驗室，南寧530023)

六味地黃顆粒對哮喘大鼠促上皮生長因子及其受體干預(yù)作用的研究

陳晶，梁麗英，宋曦

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)分子生物實驗室，南寧530023)

目的探討六味地黃顆粒對哮喘大鼠氣道重塑過程中促上皮生長因子(EGF)及促上皮生長因子受體(EGFR)可能的干預(yù)作用。方法用ELISA法檢測哮喘大鼠肺泡灌洗液中的EGF及EGFR水平，比較空白對照組、哮喘模型對照組、各用藥組之間兩種蛋白水平的差異。結(jié)果哮喘模型對照組的肺泡灌洗液EGFR水平較其他各組明顯增高(P＜0.01);六味地黃顆粒+布地奈德組、空白對照組及布地奈德組之間EGFR水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);六味地黃顆粒治療組的肺泡灌洗液中EGFR水平居于哮喘模型對照組和空白對照組之間。哮喘模型對照組EGF水平最高，明顯高于其他各組(P＜0.01);空白對照組與六味地黃顆粒+布地奈德組EGF水平差異不大(P＞0.05)，但均顯著低于其他三組(P＜0.01);六味地黃顆粒治療組EGF水平明顯高于布地奈德組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。結(jié)論六味地黃顆粒能降低哮喘大鼠肺部促上皮生長因子及其受體的生成，但其降低作用不如布地奈德明顯。

支氣管哮喘;六味地黃顆粒;促上皮生長因子;促上皮生長因子受體

自支氣管哮喘(bronchial asthma，簡稱哮喘)首次被描述至今已有數(shù)百年歷史，作為一種古老而難治的疾病，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，人們對哮喘的認(rèn)識日漸深入。早前的研究表明，嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞參與了慢性氣道炎性的形成［1］，繼而導(dǎo)致哮喘。但隨后的研究發(fā)現(xiàn)，慢性氣道炎癥假說并不能完全解釋哮喘發(fā)生發(fā)展過程中的種種問題，研究者由此提出支氣管哮喘氣道重塑假說，認(rèn)為哮喘過程中除各種炎性細(xì)胞浸潤以外，還主要表現(xiàn)為平滑肌增殖和基底膜增厚及玻璃樣變［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞是氣道重塑的重要因素，而聯(lián)系上皮細(xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的重要細(xì)胞因子就包括促上皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和促上皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)。氣道中EGF和EGFR分泌水平的失衡，直接導(dǎo)致了是氣道生長、基質(zhì)降解、氣道延長或相反［3］，由此最終決定了氣道重塑的過程。本研究旨在觀察哮喘大鼠模型中EGF、EGFR的變化趨勢，以及六味地黃顆粒對其的影響，以探討六味地黃顆粒在治療哮喘中的作用靶點。

1　材料與方法

1.1實驗動物將79只SPF級SD雄性大鼠隨機(jī)分成五組。具體分組情況如下:布地奈德組(n= 15)、六味地黃顆粒治療組(n=17)、布地奈德吸入加六味地黃顆粒治療組(n=16)、哮喘模型對照組(n=13)、空白對照組(n=18)。

1.2實驗藥物及試劑六味地黃顆粒:遵錢乙《小兒藥證直訣》中六味地黃丸的組方，即熟地黃、山萸肉、干山藥、澤瀉、牡丹皮、白茯苓，按8∶4∶4∶3∶3∶3比例制成免煎中藥飲片顆粒劑(江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，每包含生藥10 g，溫開水調(diào)制每毫升含生藥1 g。布地奈德氣霧劑(魯南貝特制藥有限公司)，0.1 mg/瓶。卵清蛋白(OVA，恒因生物有限公司提供):10 g/瓶。氫氧化鋁(天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品)。EGF、EGFR的ELISA試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.3方法

1.3.1造模第1、8天除空白對照組外，其余各組均以O(shè)VA輔以氫氧化鋁凝膠為佐劑注射致敏，2周后霧化吸入2%OVA生理鹽水混懸液激發(fā)哮喘，建立哮喘模型。從實驗第8天開始，給藥組布地奈德霧化吸入給藥，六味地黃顆粒灌胃給藥，其中布地奈德給藥方法為每次激發(fā)前1 h預(yù)先吸入8 μg/kg布地奈德20 min，六味地黃顆粒給藥方法為胃飼六味地黃丸顆粒20 g·kg－1·d－1，空白對照組不予干預(yù)。造模時間共28天。

1.3.2取材造模結(jié)束后24小時內(nèi)腹主動脈取血，后開胸，結(jié)扎大鼠右支氣管，氣管插管，用生理鹽水5 ml注入左側(cè)肺組織內(nèi)，反復(fù)抽吸，使得生理鹽水回收率在85%以上。收集肺泡灌洗液，1500 r/ min 5分鐘，離心后取上清，－80℃保存待測。

1.3.3造模成功的標(biāo)志實驗大鼠在霧化過程中出現(xiàn)不同程度的煩躁不安、呼吸增快、腹肌抽搐、大小便失禁等哮喘速發(fā)相反應(yīng)。造模結(jié)束解剖實驗大鼠，肉眼可見肺臟體積較空白對照組增大，腫脹，有形狀不規(guī)則的暗紅色充血區(qū)，病理切片HE染色可見支氣管、肺泡腔內(nèi)、肺間質(zhì)和血管周圍大量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜下水腫，黏膜皺襞增多，肺泡隔增厚，氣道平滑肌明顯增厚。

1.4指標(biāo)檢測肺泡灌洗液中EGF、EGFR的含量采用ELISA法檢測，嚴(yán)格按照實際和說明書進(jìn)行操作。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法實驗結(jié)果在計算機(jī)上建立數(shù)據(jù)庫，通過SPSS 17.0軟件計算各組不同指標(biāo)的平均值，所有計量資料經(jīng)齊性檢驗后，采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn):α=0.05。

2　結(jié)　果

2.1各組大鼠肺泡灌洗液中EGFR水平比較哮喘模型對照組的肺泡灌洗液EGFR水平高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。六味地黃顆粒+布地奈德治療組、空白對照組及布地奈德組的EGFR水平接近，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。六味地黃顆粒治療組的EGFR水平居中，既顯著低于哮喘模型組，又顯著高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，也顯著高于布地奈德組和六味地黃顆粒+布地奈德組(P＜0.05)。見表1。

2.2各組大鼠肺泡灌洗液中EGF水平比較哮喘模型對照組EGF水平最高，明顯高于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)?？瞻讓φ战M與六味地黃顆粒+布地奈德組的EGF水平相當(dāng)(P＞0.05)，兩組均顯著低于其他各組(P＜0.01)。六味地黃顆粒組EGF水平明顯高于布地奈德組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。見表2。

表1　各組大鼠肺泡灌洗液EGFR水平比較(ng/ml，±s)

表1　各組大鼠肺泡灌洗液EGFR水平比較(ng/ml，±s)

注:與哮喘模型對照組比較:aP＜0.01;與空白對照組比較:bP＜0.01;與六味地黃顆粒治療組比較，cP＜0.05。

ab六味地黃顆粒治療組　17 60.24±11.31六味地黃顆粒+布地奈德組 16 48.38±4.57ac布地奈德組　15 49.67±5.02ac43.87　＜0.001空白對照組　18 46.55±17.44a哮喘模型對照組13 95.18±12.19

表2　各組大鼠肺泡灌洗液EGF水平比較(ng/ml，±s)

表2　各組大鼠肺泡灌洗液EGF水平比較(ng/ml，±s)

注:與哮喘模型對照組比較:aP＜0.01;與空白對照組比較:bP＜0.05;與六味地黃顆粒治療組比較，cP＜0.01。

ab六味地黃顆粒治療組　17 159.58±9.48六味地黃顆粒+布地奈德組 16 85.69±6.26ac布地奈德組　15137.34±6.10abc340.64?。?.001空白對照組　18 90.70±13.71a哮喘模型對照組13 215.25±16.94

3　討　論

圍繞著哮喘疾病過程中，氣道增厚、上皮喪失功能的現(xiàn)象，研究者發(fā)現(xiàn)氣道的物理性扭曲變形本身就可以促使上皮細(xì)胞產(chǎn)生EGF，繼而造成支氣管上皮-肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，使基底膜纖維物質(zhì)沉淀，基底膜增厚［4］。上皮細(xì)胞損傷后修復(fù)及修復(fù)延遲，通過各種生長因子及其受體間的信息交流，使上皮下網(wǎng)中的肌纖維母細(xì)胞活化分化，繼而纖維沉淀，最后導(dǎo)致重塑發(fā)生［5］。由此看來，氣道上皮細(xì)胞不僅是炎癥損傷的對象，而且是哮喘發(fā)生發(fā)展的積極推動者，并因此提出上皮-間充質(zhì)營養(yǎng)單位(epithelial-mesenchymal trophic unit，EMTU)假說。本研究中哮喘模型對照組哮喘大鼠肺泡灌洗液中EGF、EGFR的水平顯著高于其他各組，尤其高于空白對照組，據(jù)此可從EMTU假說角度證實，哮喘存在氣管壁增厚、纖維增生等氣道重塑過程。

從檢測結(jié)果可知，空白對照組與六味地黃顆粒+布地奈德組、布地奈德組的EGFR水平接近。另外，六味地黃顆粒治療組哮喘大鼠肺泡灌洗液中EGFR和EGF水平高于空白對照組和布地奈德組，但明顯低于哮喘模型對照組。這可能暗示，單獨使用布地奈德就可有效減少哮喘大鼠肺部EGFR和EGF的生成，而單獨使用六味地黃顆粒盡管也能在一定程度上減少哮喘大鼠肺部EGFR和EGF的生成，但這種作用并不如布地奈德顯著。上述結(jié)果至少表明，使用布地奈德治療哮喘大鼠，能有效減少大鼠肺部表皮生長因子及其受體的生成，而六味地黃顆粒表現(xiàn)出了一定的協(xié)同作用。單純用六味地黃顆粒溶液對哮喘大鼠進(jìn)行灌胃治療也能顯著減少哮喘大鼠肺泡灌洗液EGFR和EGF水平，但這種作用并不如單獨使用布地奈德顯著。

綜上，我們認(rèn)為單純使用六味地黃顆粒可對EMTU假說中的重要因子EGFR和EGF存在一定程度的抑制作用，繼而抑制哮喘大鼠的氣道重塑過程，但這種抑制作用并不如布地奈德明顯。

［1］Bradding P.The Role Of The Mast Cell In Asthma:A Reassessment［J］.Currop In Allergy Clin Immunol，2003，3 (1):45-50.

［2］Bischof RJ，Bourke JE，Hirst SJ，et al.Measurement and impact of remodeling in the lung:airway neovascularization in asthma［J］.Proc Am Thorac Soc，2009，6(8): 673-677.

［3］Song L，Tang H，Liu D，et al.The Chronic and Short-Term Effects of Gefinitib on Airway Remodeling and Inflammation in a Mouse Model of Asthma［J］.Cell Physiol Biochem，2016，38(1):194-206.

［4］Pohunek P，Warner JO，Turzikova J，et al.Markers of eosinophilic inflammation and tissue re-modelling in children before clinically diagnosed bronchial asthma［J］.Pediatr Allergy Immunol，2005，16(1):43-51.

［5］Cho IH，Choi YJ，Gong JH，et al.Astragalin inhibits autophagy-associated airway epithelial fibrosis［J］.Respir Res，2015(16):51.

(編輯:潘明志)

A study on intervention effects of Liuwei Dihuang granule on EGF and its receptor of asthma model rats

CHEN Jing，LIANG Liying，SONG Xi
(Laboratory of Medical Molecular Biology，The First Affiliated Hospital Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning 530023，China)

ObjectiveTo investigate possible intervention effects of Liuwei Dihuang granule on epidermal growth factor (EGF)and epidermal growth factor receptor(EGFR)of asthma model rats.MethodsEGF and EGFR levels in bronchoalveolar lavage fluid of asthmatic rats were detected by ELISA method.And then，difference of the two protein levels between blank control group，asthma model control group and each treatment group were compared.ResultsEGFR levels in bronchoalveolar lavage fluid of asthma model control group were significantly higher than those of the other groups(P＜0.01).Difference of EGFR levels in bronchoalveolar lavage fluid of Liuwei Dihuang granule+budesonide group，blank control group and budesonide group was not statistically significant(P＞0.05).EGFR levels in bronchoalveolar lavage fluid of the Liuwei Dihuang granule group was between those of the asthma model control group and blank control group.Asthma model control group had the highest EGF level，significantly higher than those of other groups(P＜0.01).No significant difference was found in EGF levels of the Liuwei Dihuang granule+budesonide group and blank control group(P＞0.05)，but they were all obviously lower than the three other groups(P＜0.01).In addition，EGF levels of the Liuwei Dihuang granule group were obviously higher than those of the budesonide group，so difference was statistically significant(P＜0.01).ConclusionTraditional Chinese medicine Liuwei Dihuang granule can reduce the EGF and EGFR levels of asthma model rats，but its reducing effect is less obvious than budesonide.

bronchial asthma;Liuwei Dihuang granule;EGF;EGFR

R562.2+5;R361+.3

ADOI:10.3969/j.issn.1003-1383.2016.03.004

廣西自然科學(xué)基金項目(2013GXNSFBA019136)

陳晶，女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士。E-mail:27907854@qq.com

2016－04－21

2016－06－13)