楊紅文，韓勇，劉鏡，肖禮華，粟朝芝

(1．貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽(yáng) 550001;2．貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005;3．貴州省遵義市畜牧技術(shù)推廣站，貴州 遵義 563100)

貴州地方黃牛品種遺傳分化的分子評(píng)估

楊紅文1，韓勇2，劉鏡2，肖禮華3，粟朝芝2

(1．貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴州 貴陽(yáng) 550001;2．貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550005;3．貴州省遵義市畜牧技術(shù)推廣站，貴州 遵義 563100)

選用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)推薦的23對(duì)微衛(wèi)星引物，采用熒光標(biāo)記－多重PCR技術(shù)檢測(cè)了4個(gè)貴州地方黃牛品種的遺傳分化。結(jié)果顯示，思南牛、關(guān)嶺牛、威寧牛、黎平牛平均雜合度分別為0．71、0．69、0．69、0.65，23個(gè)位點(diǎn)多態(tài)信息含量在0．38～0．84之間，高度多態(tài)位點(diǎn)21個(gè)，中度多態(tài)位點(diǎn)2個(gè)。檢測(cè)結(jié)果為貴州省本地黃牛品種分類提供了分子水平的科學(xué)依據(jù)。

地方黃牛品種;微衛(wèi)星;遺傳分化

開(kāi)展畜禽品種遺傳分化的分子評(píng)估，為畜禽的品種分類、保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，有利于保護(hù)畜禽的優(yōu)良特性和選育出能適應(yīng)環(huán)境、疾病和市場(chǎng)需求的新品種，對(duì)促進(jìn)畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義［1～8］。目前，關(guān)于貴州黃牛品種遺傳分化在分子水平的評(píng)估研究?jī)H有少量文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選用聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)和國(guó)際動(dòng)物遺傳學(xué)會(huì)(ISAG)推薦的23對(duì)微衛(wèi)星引物，采用熒光標(biāo)記－多重PCR技術(shù)，分析了4個(gè)貴州地方黃牛品種的遺傳分化。

1 材料和方法

1．1 材料本研究中4個(gè)牛品種血樣的采集地及采集數(shù)量見(jiàn)表1。每個(gè)牛品種隨機(jī)采集約60頭，其中公牛不少于10頭。要求采樣個(gè)體具備品種的典型特征，并且在3代或2代內(nèi)沒(méi)有血緣關(guān)系。采用前腔靜脈采血，每頭牛采血量10 mL。新鮮血液用1︰1的裂解液(100 mmol/L Tris－HCL，100 mmol/LEDTA，2%SDS)裂解，常溫下即可運(yùn)輸，－20℃長(zhǎng)期保存。

表14 個(gè)牛品種名稱和采樣情況

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 基因組DNA提取:血液DNA提取采用常規(guī)酚氯仿抽提法。Taq酶、10×buffer均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，dNTPs購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，POP4膠、甲酰胺等電泳檢測(cè)試劑均使用美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司進(jìn)口試劑。提取出的基因組DNA首先經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格，然后用生物分光光度計(jì)將其濃度調(diào)整為20～50 ng/μL后即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1．2．2 多重PCR擴(kuò)增:根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)推薦的引物，選取了其中12對(duì)微衛(wèi)星引物:CSSM014、CSSM016、CSSM022、ETH3、ETH10、ETH225、BM1818、BM1824、BM2113、TGLA122、TGLA126、TGLA227、MGTG7、TGLA48、TGLA53、TGLA263、SPS113、SPS115、GSSM036、MGTG4B、TGLA57、TGLA73、AGLA293，引物信息見(jiàn)FAO網(wǎng)址(http://www．fao．org)。上游引物5端標(biāo)記熒光，根據(jù)各引物的序列、復(fù)性溫度、目的片段大小，將引物有機(jī)組合進(jìn)行擴(kuò)增，分別對(duì)引物濃度、Mg2+濃度、復(fù)性溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，取得最佳擴(kuò)增效果。

PCR反應(yīng)體系為:2．5 μL MgCl2，2．5 μL dNTP(2 mM)，2．5 μL 10×緩沖液，上下游引物各1 μL，1 μL TaqE(1 U/μL)，1 μL DNA，13．5 μL dH2O，總體系為25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4 min;94℃變性50 s，退火50 s(退火溫度視引物而定)，72℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1．2．3 PCR產(chǎn)物檢測(cè):PCR產(chǎn)物擴(kuò)增成功后，采用ABI3100－Avant全自動(dòng)基因分析儀進(jìn)行檢測(cè)，微衛(wèi)星基因型用儀器自帶軟件Gene Mapper Vers ion 3．2進(jìn)行分析。

1．2．4 統(tǒng)計(jì)分析:用POPGENE1．32軟件(http://www．ualberta．ca/～fyeh/)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2．1 遺傳距離通過(guò)3種途徑估算的遺傳距離見(jiàn)表2。Nei’s最小遺傳距離在0．017 9～0．036 4之間，Nei’s標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離在0．117 8～0．061 8之間，Nei’s最大遺傳距離在0．068 6～0．078 1之間。3種不同遺傳距離估算方法獲得的結(jié)果均顯示，關(guān)嶺牛和思南牛之間遺傳距離最小，黎平牛和思南牛之間遺傳距離最大。

表24 個(gè)品種兩兩間的遺傳距離

2．2 基因型一致概率我省4個(gè)地方黃牛品種兩兩間基因型一致的概率見(jiàn)表3，關(guān)嶺牛和思南牛之間的概率最大，為2．892×10－23;黎平牛和思南牛之間的概率最小，為1．001×10－24。

表34 個(gè)地品種兩兩間基因型一致的概率

2．3近郊系數(shù)和分化系數(shù)我省4個(gè)地方牛品種在23個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的F－statistics分析結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，4個(gè)地方牛品種在各位點(diǎn)上Fit為－0．956～0．992，平均值0．242;Fis為－0．949～0．973，平均值0．333。Fst值在位點(diǎn)TGLA263最大，為0.798;在位點(diǎn)TGLA53最小，為0．510。Fst平均值為0．713，表明28．7%的遺傳變異發(fā)生在品種內(nèi)，71．3%的遺傳變異發(fā)生在品種間，表明各品種的遺傳變異主要發(fā)生在品種間。

表4 群體分化的F統(tǒng)計(jì)和Fisher’s精確檢驗(yàn)

3 討論

3．1 關(guān)于遺傳距離Nei等通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬對(duì)各種遺傳距離進(jìn)行研究，證明在分析物種內(nèi)群體間的遺傳變異時(shí)，通過(guò)最小遺傳距離、標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離、最大遺傳距離3種途徑估算的遺傳距離最能反映出群體間變異實(shí)際情況［11～15］。本研究3種不同遺傳距離估算方法獲得的結(jié)果均顯示，關(guān)嶺牛和思南牛之間遺傳距離最小，黎平牛和思南牛之間遺傳距離最大。

3．2關(guān)于近郊系數(shù)和分化系數(shù)品種內(nèi)近交系數(shù)(Fit)、總近交系數(shù)(Fis)、品種間分化系數(shù)(Fst)均是反應(yīng)品種間近交程度或遺傳分化的指標(biāo)。Fis表示的是亞群內(nèi)個(gè)體間由于非隨機(jī)交配從而導(dǎo)致的亞群內(nèi)雜合度的缺乏，F(xiàn)it則反映總品種雜合度的缺乏程度;Fst反映的是各亞群內(nèi)平均雜合度與總品種平均雜合度的差異程度。目前，基于微衛(wèi)星DNA分子標(biāo)記對(duì)貴州黃牛品種遺傳分化研究較少，能提供的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)不多。我省地方黃牛品種71．3%的遺傳分化發(fā)生在品種間，28．7%的遺傳變異發(fā)生在品種內(nèi)。此結(jié)果為我省本地黃牛品種分類提供了分子水平的科學(xué)依據(jù)，應(yīng)用前景廣闊。

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Molecular Evaluation on Genetics Differentiation of Native Yellow Cattle Breeds from Guizhou Province

Yang Hongwen1，Han Yong2，Liu Jing2，Xiao Lihua3，Su Chaozhi2
(1．Guizhou Management Station of Animal Genetic Resources，Guiyang Guizhou 550001，China;2．Guizhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Guiyang Guizhou 550005，China;3．Zunyi Committee for Agriculture，Zunyi Guizhou 563100，China)

Four native yellow cattle breed from Guizhou province were studiedthe genetics differentiation by using the multiple PCR with fluorescence labeling－method．A total of 23 pair primers recommended by FAO and ISAG were used to amplify．The results showed the mean heterozygosity of Sinan cattle，Guangling cattle，Weining cattle，and Lipingcattle are 0．71，0．69，0．69 and 0．65 respectively．Thepolymorphism information contents(PIC)of 23 loci ranged from 0．38 to 0．84，including 21 highly polymorphic loci and 2 moderately polymorphic loci．These results provided the molecular proof for the varieties classificationof native yellow cattle breed from Guizhou province．

Nativeyellow Cattle Breed;Microsatellite;Genetics Differentiation

S823．2:Q75

A

1007－1474(2016)06－0005－03

2016－09－05

貴州省自然科學(xué)基金(黔科合J字［2011］2224號(hào))

楊紅文(1979—)，男，高級(jí)畜牧師，研究方向:分子遺傳學(xué)與動(dòng)物育種。