吉圣珺，魏曉群，莫冠文，梅湛強，張培芳

·論著·

P38MAPK在低氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用

吉圣珺1，魏曉群1，莫冠文1，梅湛強1，張培芳1

目的 探討P38MAPK在低氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用。方法 將人肺微血管內(nèi)皮細胞株進行復蘇及傳代培養(yǎng)，分為空白對照組、低氧組（低氧6 h、12 h、24 h）、腫瘤壞死因子（TNF-α）刺激組（用10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的TNF-α進行刺激）、模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml聯(lián)合刺激）及通路阻斷劑組（加入通路阻斷劑SB203580進行干預）。Western-blot法分析各組細胞中P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）表達，流式細胞術(shù)分析各組細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活力，流式細胞術(shù)和TUNEL法聯(lián)合檢測細胞凋亡。結(jié)果 與空白對照組相比，模型組p-P38MAPK表達升高（P＜0.05）。與低氧組（24 h）、TNF-α刺激組（100 ng/ ml）相比，模型組（低氧24 h+TNF-α100ng/ml聯(lián)合刺激）細胞活力均下降（P均＜0.01）；與模型組相比，通路阻斷劑組細胞Caspase-3活力下降（P＜0.01）。與模型組相比，通路阻斷劑組細胞凋亡率及凋亡指數(shù)均下降（P＜0.01）。結(jié)論 P38MAPK在低氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞中具有促凋亡作用，P38MAPK 通路阻斷劑對低氧及炎癥聯(lián)合刺激損傷的人肺微血管內(nèi)皮細胞具有保護作用。

P38MAPK；人肺微血管內(nèi)皮細胞；細胞凋亡

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是常見的嚴重危害人類健康的呼吸系統(tǒng)疾病。肺動脈高壓（PH）作為其主要并發(fā)癥之一，被認為是影響COPD預后的獨立危險因素［1］，而其發(fā)生機制又與肺動脈內(nèi)皮細胞的凋亡密切相關(guān)［2］。在COPD患者中，由于持續(xù)存在的缺氧及炎癥狀態(tài)導致肺血管內(nèi)皮細胞的凋亡增加，出現(xiàn)了肺動脈的重構(gòu)，最終導致嚴重的PH。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是一類廣泛存在于哺 乳動物細胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導通路，參與細胞的生長、分化、凋亡等許多生理過程［3］。目前有關(guān)于MAPK參與內(nèi)皮細胞凋亡研究最多的信號通路包括：P38MAPK信號通路、ERK通路等。本研究擬通過檢測P38MAPK通路在低氧及腫瘤壞死因子（TNF-α）聯(lián)合刺激誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞（HPMVECs）凋亡模型中的活化情況，探討P38MAPK在缺氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡中的作用。

1　材料與方法

1.1實驗材料 人肺微血管內(nèi)皮細胞株購于上海細胞庫，10％胎牛血清及高糖細胞培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，四甲基偶氮唑藍購于美國Sigma公司，Caspase-3活性檢測試劑盒購于美國的BD公司，HRP羊抗兔武漢BOSTER公司，Phospho-p38 MAPK購自美國Cell Signaling Technology公司，GAPDH購自北京康為世紀生物科技有限公司，P38MAPK阻斷劑（SB203580）購自美國Sigma公司，流式細胞儀購于美國的BD公司，光學顯微鏡購于重慶奧特光學儀器有限公司，電熱恒溫培養(yǎng)箱購于上海博迅實業(yè)公司KPL公司，AnnexinV /PI凋亡檢測試劑盒購于瑞士Roche公司，蛋白印跡實驗設備購自美國 BioRad 公司。

1.2方法

1.2.1HPMVEC的復蘇和傳代培養(yǎng) 從液氮保存罐中取出凍存管（含原代HPMVEC株），立即放入37℃水浴中，快速搖晃，直至凍存液完全融化。將其置于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃ 、5％二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。內(nèi)皮細胞呈鵝卵石樣貼壁生長，當細胞生長至90％融合時用0.25％乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶進行消化傳代，取第四代血管內(nèi)皮細胞進行實驗。

1.2.2實驗分組及處理 分為空白對照組（用10％ 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細胞，置于體積分數(shù)5％、氣體成分為二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)），低氧刺激組（低氧6 h、12 h、24 h，用10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細胞，置于氣體成分為體積分數(shù)3％氧氣、5％二氧化碳和 92％氮氣的三氣培養(yǎng)箱中進行低氧培養(yǎng)），TNF-α刺激組（用10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml的TNF-α進行刺激，然后用10％胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基處理內(nèi)皮細胞，置于體積分數(shù)5％、氣體成分為二氧化碳培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)）、模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml）、通路阻斷劑組（在模型組中加入通路阻斷劑SB203580進行干預）。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活力 分別收集各組細胞，1500 r/min，離心10 min，預冷的PBS洗滌細胞兩次，300 g，4℃離心5 min，收集5×105細胞；加TF2-DEVD-FMK 37℃反應1 h；流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數(shù)和平均熒光強度。

1.2.4流式細胞術(shù)和TUNEL法聯(lián)合檢測細胞凋亡每組取3個6孔板的培養(yǎng)孔，胰酶消化法（不含EDTA）收集細胞，1000 g離心5 min，棄上清，PBS液重懸細胞后，離心，重復2次后棄上清。分別加入BindingBuffer液200重懸并進行細胞計數(shù)，調(diào)整細胞數(shù)至105個/ml。取200 μl細胞懸液，加入5 μl Annexin-FITC混勻，室溫避光10 min。再加入5 μl PI染液混勻，流式細胞儀進行檢測。流式細胞儀分析：每份樣品取1×104個細胞PI染色，做DNA分析。TUNEL法檢測：采用原位末端標記法（TUNEL）檢測各組HPMVEC凋亡情況，并計算凋亡指數(shù)（AI）：待測細胞用多聚甲醛固定，Triton-100檸檬酸鈉處理，每孔加入45 μl TUNEL標記液，5 μl末端轉(zhuǎn)移酶溶液，37℃溫育2 h，沖洗，用熒光顯微鏡觀察，用DAB顯色的標本加入50 μl TUNEL顯色液，37℃溫育30 min，DAB室溫顯色10 min，PBS洗滌3次×5 min，蘇木素復染數(shù)秒，流水沖洗，梯度酒精脫水，晾干，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察棕黃色的細胞核為陽性結(jié)果，藍色為蘇木素復染的細胞核。

1.2.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間對比采用Tukey法分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1MTT比色法檢測的細胞活力 低氧6 h、12 h、空白對照組的相對細胞活力無差異，但顯示有逐步下降的趨勢，而低氧24 h組的相對細胞活力明顯低于空白對照組（P=0.041）（表1）。TNF-α10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml分別與TNF-α100 ng/ml組間存在統(tǒng)計學差異（P ＜0.05），而TNF-α100ng/ml的相對細胞活力明顯低于空白對照組（P=0.006），TNF-α對細胞活力的抑制與TNF-α濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（表2）。與低氧24 h、TNF-α100 ng/ml分別單獨作用組比較，模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ ml聯(lián)合刺激）的相對細胞活力更低，存在統(tǒng)計學差異（P值分別為0.002、0.005）（表3）。

表1　不同低氧刺激時間下HPMVEC的活力（±s）

表1　不同低氧刺激時間下HPMVEC的活力（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05

組別NOD值相對細胞活力（％）空白對照組31.97±0.05100±0.00低氧6 h組31.88±0.0595.43±3.29低氧12 h組31.84±0.0193.57±3.65低氧24 h組31.80±0.03a91.60±2.92a

表2　不同TNF-α濃度刺激下HPMVEC的活力（±s）

表2　不同TNF-α濃度刺激下HPMVEC的活力（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與TNF-α10 ng/ml比較，bP ＜0.05；與TNF-α20 ng/ml 比較，cP＜0.05；與TNF-α50 ng/ml比較，dP＜0.05

組別NOD值相對細胞活力（％）空白對照組31.97±0.05100±0.00 TNF-α10 ng/ml組31.84±0.0193.68±3.30 TNF-α20 ng/ml組31.81±0.02a92.24±2.55aTNF-α50 ng/ml組31.71±0.02a87.30±2.64aTNF-α100 ng/ml組31.53±0.02abcd77.93±2.97abcd

2.2Western blot檢測p-P38MAPK 與空白對照組相比，模型組p-P38MAPK表達升高（1.75± 0.25），存在統(tǒng)計學差異（P=0.035），根據(jù)上述磷酸化蛋白表達情況，加入P38MAPK通路阻斷劑SB203580后，可使p-P38MAPK的表達下降（0.92±0.25），與模型組比較，存在統(tǒng)計學差異（P=0.015）（圖1）。

2.3Caspase-3的活力檢測 通路阻斷劑組（16.89％±0.76％）與模型組（25.39％±0.72％）相比，caspase-3的活性明顯下降，存在統(tǒng)計學差異（P=0.001）（表4）。

表3　各實驗組刺激下HPMVEC的活力（±s）

表3　各實驗組刺激下HPMVEC的活力（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與低氧24 h組比較，bP ＜0.05；與TNF-α100ng/ml組比較，cP＜0.05

組別N OD值相對細胞活力（％）空白對照組31.97±0.05100±0.00低氧24 h組31.80±0.03a91.60±2.92aTNF-α100 ng/ml組31.53±0.02ab77.93±2.97ab低氧24 h+TNF-α100 ng/ml組31.30±0.01abc65.93±1.87abc

圖1　各實驗組p-P38MAPK的比較［與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml組）比較，bP＜0.05］

2.4流式細胞儀鑒定細胞凋亡 通路阻斷劑組（16.45％±0.10％）與模型組（25.53％±0.94％）相比，細胞凋亡率明顯下降，存在統(tǒng)計學差異（P＜0.001）（圖2）。

2.5TUNEL檢測細胞凋亡 與模型組（86.00％ ±1.06％）相比，通路阻斷劑組（37.13％± 1.01％）細胞凋亡指數(shù)下降，存在統(tǒng)計學差異（P ＜0.001）（圖3）。

3　討論

表4　各實驗組細胞Caspase-3的活力比較（±s）

表4　各實驗組細胞Caspase-3的活力比較（±s）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與模型組（低氧24 h+TNF-α100ng/ml組）比較，bP＜0.05

組別NCaspase-3的活力（％）空白對照組30.39％±0.22％低氧24 h+TNF-α100 ng/ml組325.39％±0.72％aSB203580+低氧+TNF-α組316.89％±0.76％ab

圖2　各實驗組細胞凋亡率的比較［與空白對照組比較，aP＜0.05；模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml組）比較，bP＜0.05］

圖3　各實驗組細胞凋亡率的比較［與空白對照組比較，aP＜0.05；模型組（低氧24 h+TNF-α100 ng/ml組）比較，bP＜0.05］

COPD引起的PH具有多因性，缺氧及炎癥引起肺血管收縮及重構(gòu)是COPD發(fā)生PH的重要病理生理基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細胞凋亡是PH發(fā)病的重要機制［4，5］。缺氧或炎癥（高濃度的TNF-α）均可通過誘導血管內(nèi)皮細胞的凋亡，誘導肺動脈血管壁重構(gòu)，導致PH的發(fā)生［6-8］。然而，目前許多關(guān)于COPD相關(guān)性PH的體外細胞模型的建立均以缺氧或炎癥因子作為單一誘導因素，COPD患者卻往往同時存在的缺氧及炎癥的復合狀態(tài)。因此，COPD相關(guān)的PH體外細胞模型，在缺氧及炎癥兩者復合因素刺激下建立，更符合疾病的病理生理狀態(tài)。而抗血管內(nèi)皮細胞凋亡的研究，將對延緩COPD患者PH的發(fā)展具有重要的意義。

MAPK信號通路在血管內(nèi)皮細胞凋亡過程中發(fā)揮著及其重要的作用，但由于其可被多種上游信號激活，激活后又可導致多種轉(zhuǎn)錄因子的表達，并與其他信號通路存在相互作用。因此，P38MAPK可因刺激物和底物的不同，在血管內(nèi)皮細胞凋亡過程中發(fā)揮不同的效應［9］。有研究者在缺氧復氧誘導大鼠肺內(nèi)皮細胞凋亡的模型中，證實了激活的P38MAPK發(fā)揮抗凋亡作用，而加入P38MAPK阻斷劑 SB203580后則導致缺氧復氧的內(nèi)皮細胞凋亡增加［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，低氧及TNF-α聯(lián)合刺激HPMVEC可導致磷酸化P38MAPK表達升高，同時伴有Caspase-3活力升高，而加入P38MAPK 抑制劑（SB203580）后，可顯著降低人肺微血管內(nèi)皮細胞的凋亡，這一結(jié)果與李泉［11］等在CD8+T淋巴細胞誘導血管內(nèi)皮細胞凋亡的檢測結(jié)果一致。

本研究采用Annexin V-FITC/PI雙染法及TUNEL法檢測低氧及TNF-α聯(lián)合刺激對HPMVEC凋亡的影響，結(jié)果顯示低氧及TNF-α聯(lián)合刺激細胞凋亡率及凋亡指數(shù)較正常對照組明顯增加，而加入P38MAPK通路阻斷劑（SB203580）后，可顯著降低細胞凋亡率及凋亡指數(shù)。本研究結(jié)果證實了低氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導人肺微血管內(nèi)皮細胞的凋亡與P38MAPK的磷酸化激活密切相關(guān)，P38MAPK通路阻斷劑（SB203580）可抗低氧及炎癥聯(lián)合刺激誘導的人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡。P38MAPK通路在缺氧聯(lián)合炎癥刺激人肺微血管內(nèi)皮細胞凋亡中具有促凋亡作用，該研究結(jié)果有望為COPD繼發(fā)PH的防治提供新的思路和靶點。

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本文編輯：蘆潔，田國祥

Role of P38MAPK in human pulmonary microvascular endothelial cells apoptosis induced by hypoxia and inflammation combination

JI Sheng-jun*， WEI Xiao-qun， MO Guan-wen， MEI Zhan-qiang， ZHANG Pei- fang. *The first people's Hospital of Foshan. Foshan， 528000， China.

ZHANG Pei-fang， E-mail： zhangpf0757@163.com

Objective To investigate the effect of p38mitogen-actvated protein kinase （P38MAPK） on the apoptosis of human pulmonary microvascular endothelial cells induced by hypoxia and inflammation. Methods Human pulmonary microvascular endothelial cell line was recovered， subcultured， divided into blank control group，hypoxia group （hypoxia 6 h， 12 h， 24 h） and TNF alpha stimulation group （10 ng/ml， 20 ng/ml， 50 ng/ml， 100 ng/ml TNF alpha）， model group （hypoxia combined with 100 ng/ml TNF alpha ） and pathway blocker group （SB203580）. P38MAPK expression in each group was detected by Western blotting. Caspase-3 activity in each group was analyzed by flow cytometry. Apoptosis were detected by combination of flow cytometry and TUNEL assay. Results Compared with the blank control group， p-P38MAPK expression of model group was increased （P＜0.05）. Caspase-3 activity of model group （24 h hypoxia combined with 100ng/ml TNF alpha） was reduced compared with hypoxia group （24 h） and TNF alpha stimulation group （100 ng/ml） （P＜0.01）； Caspase-3 activity of pathway blocker group was reduced compared with model group （P＜0.01）. Apoptosis rate and apoptotic index were reduced in pathway blocker group than model group （P＜0.01）. Conclusion P38MAPK plays a role in promoting in human pulmonary microvascular endothelial cells apoptosis induced by hypoxia and inflammation. P38MAPK pathway blocker （SB203580） has protective effect on hypoxia and inflammation in human pulmonary microvascular endothelial cells.

P38MAPK； Human pulmonary microvascular endothelial cells； Apoptosis

R563

A

1674-4055（2016）06-0676-04

佛山市衛(wèi)生及計生局醫(yī)學科研立項課題（2015255）

1528000 佛山，廣東省佛山市第一人民醫(yī)院呼吸科

張培芳，E-mail：zhangpf0757@163.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.06.09

［1］ M，Nakano K，Hiramoto T，et al. Significance of pulmonary artery pressure in emphysema patients with mild-to-moderate hypoxemia［J］. Respir Med，2003，97（8）：915-20.