趙秋伶,張尤華,于曉艷

(遼寧工程技術(shù)大學(xué)　礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧　葫蘆島　125105)

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適體熒光分析法檢測(cè)養(yǎng)殖廢水中四環(huán)素類抗生素

趙秋伶*,張尤華,于曉艷

(遼寧工程技術(shù)大學(xué)礦業(yè)技術(shù)學(xué)院，遼寧葫蘆島125105)

建立了核酸適體識(shí)別-熒光探針技術(shù)檢測(cè)養(yǎng)殖廢水中土霉素、四環(huán)素、金霉素及強(qiáng)力霉素4種四環(huán)素類抗生素(TCs)總殘留量的新方法。兩段DNA對(duì)TCs共同識(shí)別后折疊成穩(wěn)定的 “發(fā)卡型” 雙鏈結(jié)構(gòu)，核酸染料4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)能插入“發(fā)卡”部位產(chǎn)生熒光信號(hào)發(fā)射，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對(duì)TCs的定量檢測(cè)。在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，以土霉素為目標(biāo)分子建立工作曲線，在10～50 nmol/L范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)濃度呈良好線性關(guān)系，土霉素的檢出限為2.3 nmol/L。用四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素分別進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平均回收率為88.5%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)為3.2%～6.7%。5個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)水樣中均有TCs檢出，檢出量在7.6～42.7 nmol/L之間。該方法簡(jiǎn)單、靈敏、快速，可滿足養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中TCs總殘留量的測(cè)定要求。

核酸適體；熒光分析法；四環(huán)素類抗生素；快速檢測(cè)；廢水

四環(huán)素類抗生素(TCs)是由放線菌產(chǎn)生的一類廣譜抗菌素，其結(jié)構(gòu)中含有并四苯基本骨架，在酸性和堿性條件下均不穩(wěn)定[1]。TCs主要品種有土霉素、四環(huán)素、金霉素、強(qiáng)力霉素等。TCs被廣泛用作獸藥，同時(shí)又作為一種生長(zhǎng)促進(jìn)劑被添加到飼料中用于畜牧業(yè)、漁業(yè)等[2]。TCs在畜禽體內(nèi)難以被腸胃吸收，約 30%～90% 以母體化合物的形態(tài)排出，殘留于糞便、尿液及養(yǎng)殖水體中，并進(jìn)入土壤、地表水及地下水等環(huán)境受體中，給人類健康造成潛在危害[3]。我國(guó)TCs的用量每年達(dá)數(shù)千噸，濫用、違規(guī)使用和使用不當(dāng)?shù)那闆r非常嚴(yán)重。因此必須加強(qiáng)對(duì)食品和養(yǎng)殖業(yè)廢水中TCs殘留的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)力度，發(fā)展快速靈敏的檢測(cè)方法。

核酸適體是人工合成的單鏈寡核苷酸(DNA 或RNA)[4]，有化學(xué)抗體之稱，并具有抗體所不具備的優(yōu)點(diǎn)，如易合成，易引入修飾基團(tuán)用于標(biāo)記和固定化，具有高親合力和良好的穩(wěn)定性等[5-7]。適體作為新的識(shí)別元素極大地促進(jìn)了生物傳感器的發(fā)展。土霉素(OTC)的核酸適體已被成功篩選[8]，具有良好的特異性及親和力，目前多種基于適體檢測(cè)OTC 的方法已被報(bào)道，如電化學(xué)、納米金、酶聯(lián)等[9-11]。適體作為識(shí)別元素的傳感器滿足簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的要求，且靈敏度高、特異性好，尤其適合發(fā)展現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)時(shí)檢測(cè)[12-14]。適體傳感器彌補(bǔ)了傳統(tǒng)儀器分析法的不足，但仍存在缺陷，如適體檢測(cè)OTC的傳感體系是簡(jiǎn)單水樣，直接應(yīng)用于實(shí)際試樣時(shí)仍存在困難。

2014年，Gu課題組[15]將76-堿基序列的 OTC 核酸適體優(yōu)化成 8-堿基序列的短鏈核酸適體(5′-CGGTGGTG-3′)，基于金納米粒子比色分析法檢測(cè) OTC 時(shí)，靈敏度提高了500倍，并且該核酸適體對(duì)四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素均具有良好的親和力。本研究以此核酸適體作為識(shí)別元素，建立了基于適體構(gòu)象變化的熒光傳感器，快速、靈敏檢測(cè)了養(yǎng)殖廢水中土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素的總殘留量。本方法采用微孔板上固定的 DNA 識(shí)別目標(biāo)分子，因識(shí)別和檢測(cè)分開(kāi)進(jìn)行，有效地排除了試樣中的熒光物質(zhì)對(duì)檢測(cè)信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜試樣中TCs的熒光分析檢測(cè)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

黑色96 微孔板(康寧)；親和素、牛血清白蛋白(BSA)及四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素均購(gòu)于美國(guó) Sigma 公司，土霉素、四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素使用前以甲醇配成0.1 mmol/L的儲(chǔ)備液；核酸外切酶Ⅰ(E.coliExonucleaseⅠ)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)，DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)均由上海生工生物工程公司合成，經(jīng)HPLC純化后，用超純水配成100 μmol/L儲(chǔ)備液；緩沖溶液(碳酸鹽緩沖液：0.5 mol/L，pH 9.0；PBS緩沖液：0.1 mol/L，pH 7.4；PBST緩沖液：0.1 mol/L，pH 7.4，含2 mmol/L MgCl2和0.12% Tween 20；結(jié)合緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，含100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，5 mmol/L KCl，1 mmol/L CaCl2，0.02% Tween 20)；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，1 mg/mL，乙醇)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，使用前以結(jié)合緩沖液稀釋100倍；養(yǎng)殖廢水采自錦州北鎮(zhèn)的規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)；其它試劑為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q制備,18.2 MΩ·cm)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1微孔板包被親和素親和素用碳酸鹽緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度,每孔包被100 μL，4 ℃反應(yīng)12 h后,用PBST緩沖溶液清洗數(shù)次，每次5 min，拍干。最后用1% BSA 封閉孔板，反應(yīng)1 h后，用PBST洗滌3次。

1.2.2DNA固定至微孔板實(shí)驗(yàn)在PBS緩沖液中進(jìn)行，首先向PBS中加入檢測(cè)DNA(1)，配成合適濃度。親和素包被的微孔板凹槽用200 μL PBST洗滌3次，每次5 min。然后在微孔板的每個(gè)凹槽中加入100 μL DNA(1)，置于37 ℃搖床反應(yīng)2 h。將DNA(1)的5′端是生物素標(biāo)簽，通過(guò)生物素與親和素的特異相互作用，將DNA(1)固定到親和素包被的微孔板的凹槽。凹槽用200 μL PBST洗滌3次，每次 5 min，以去除未反應(yīng)或吸附的DNA。然后加1% BSA做封閉反應(yīng)，反應(yīng)1 h，反應(yīng)完畢用PBST洗滌3次。檢測(cè)DNA(1)包被的微孔板立即用于下步反應(yīng)。

1.2.3識(shí)別反應(yīng)與工作曲線的建立OTC標(biāo)準(zhǔn)溶液用結(jié)合緩沖液稀釋成系列濃度，分別加入到包被了檢測(cè)DNA(1)的微孔板中,每孔100 μL，同時(shí)加入DNA(2)，保證其濃度相對(duì)于DNA(1)略過(guò)量，室溫孵育40 min，DNA(1)和DNA(2)與OTC充分反應(yīng)。在反應(yīng)液中加入1.0 μL核酸外切酶Ⅰ(Exo Ⅰ，5 U/μL)和11 μL 10×Exo Ⅰ緩沖液，37 ℃孵育30 min，未與OTC作用的DNA(1)和DNA(2)被Exo Ⅰ水解，反應(yīng)完畢，倒掉反應(yīng)液，用200 μL PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min。然后在微孔板凹槽中加入100 μL 適當(dāng)濃度的核酸染料(DAPI)，室溫孵育10 min。用酶標(biāo)儀測(cè)定熒光光譜。DAPI的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為358 nm和461 nm。未加入OTC前,測(cè)得熒光強(qiáng)度為IF0；加入OTC后,測(cè)得熒光強(qiáng)度為IF，以IF定量分析OTC濃度，并繪制工作曲線。

1.2.4加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)將4 ℃保存的自家養(yǎng)魚(yú)廢水離心取上清液，向樣品中分別添加10.0，30.0 nmol/L的四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素標(biāo)準(zhǔn)液，室溫下放置過(guò)夜后，再次離心，取上清液。用建立的方法檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)工作曲線計(jì)算回收量，同時(shí)計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中TCs總殘留的檢測(cè)取錦州北鎮(zhèn)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖廢水，離心取上清液，用建立的方法檢測(cè)熒光強(qiáng)度，再根據(jù)工作曲線計(jì)算檢出量。

2　結(jié)果與討論

2.1實(shí)驗(yàn)原理

自動(dòng)化系統(tǒng)的主要功能為：數(shù)據(jù)采集、傳輸和處理。通過(guò)端站的傳感器和執(zhí)行端完成數(shù)據(jù)的采集和命令執(zhí)行；各站的數(shù)據(jù)通信設(shè)備完成數(shù)據(jù)傳輸任務(wù)；最后由監(jiān)控中心站的微機(jī)系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)處理工作，包括數(shù)據(jù)識(shí)別、校驗(yàn)、存貯和分析，并將處理后的數(shù)據(jù)和結(jié)果進(jìn)行顯示、存儲(chǔ)和打印。

實(shí)驗(yàn)原理如圖1 所示，黑色微孔板上固定的DNA(1)序列(5′-Biotin-TTAAAGGTG-3′)經(jīng)專門(mén)設(shè)計(jì),其5′端帶有生物素標(biāo)簽，通過(guò)生物素與親和素的特異相互作用，被固定到親和素包被的微孔板上。DNA(2)序列(5′-CGGTTTTA-3′)也經(jīng)專門(mén)設(shè)計(jì)。DNA(2)中的TTTA和DNA(1)中的TAAA反向互補(bǔ)，在溶液中存在平衡反應(yīng)。DNA(2)和DNA(1)的粗體序列合在一起為T(mén)Cs的核酸適體，識(shí)別TCs后DNA(2)和DNA(1)發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)換并形成穩(wěn)定的“發(fā)卡型”雙鏈結(jié)構(gòu)(圖中DNA-TCs)，不再被外切核酸酶Ⅰ(Exo Ⅰ)水解，核酸染料DAPI插入雙鏈的小溝中間，產(chǎn)生熒光信號(hào)發(fā)射；無(wú)TCs時(shí)，微孔板上固定的DNA(1)和游離的DNA(2)被Exo Ⅰ剪切，“發(fā)卡型”雙鏈結(jié)構(gòu)不存在，DAPI無(wú)法插入，無(wú)熒光信號(hào)發(fā)射。Exo Ⅰ是單鏈特異性3′→5′核酸外切酶，可特異性地提高檢測(cè)信號(hào)，同時(shí)降低背景及噪音信號(hào)，提高分析的靈敏度。由于本研究檢測(cè)的是成分復(fù)雜并發(fā)射一定強(qiáng)度熒光信號(hào)的養(yǎng)殖廢水體系[16],將DNA(1)固定到微孔板后，能實(shí)現(xiàn)高效快速分離，有效去除非特異性干擾，進(jìn)而試樣中的復(fù)雜成分及熒光成分對(duì)檢測(cè)信號(hào)均不產(chǎn)生影響，提高了檢測(cè)靈敏度。

圖1　傳感器的原理圖Fig.1　Schematic illustration of the sensor

2.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.2.1微孔板包被親和素濃度的優(yōu)化生物素DNA通過(guò)與包被于微孔板上的親和素之間的特異性結(jié)合固定于微孔板上，適合的親和素包被濃度是實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)?？疾炝擞H和素包被濃度分別為10，20，30，40，50，60，70 mg/L時(shí),包被前后溶液在280 nm處吸光度值的減少量ΔA(ΔA=A1-A2)(A1為包被前，A2為包被后)。結(jié)果顯示,在親和素包被濃度為50 mg/L時(shí),吸光度值減少最為明顯,表明此時(shí)微孔板已被親和素飽和。因此,親和素包被濃度采用50 mg/L。

2.2.2DNA(1)包被濃度的優(yōu)化固定親和素包被濃度為50 mg/L，在過(guò)量DNA(2)存在時(shí)，考察了濃度分別為20，30，40，50，60，70 nmol/L 的DNA(1)包被微孔板后，與500 nmol/L的OTC發(fā)生識(shí)別反應(yīng)后的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示，DNA(1)包被濃度為40 nmol/L時(shí)，461 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度最大，表明此時(shí)微孔板包被的DNA(1)最多。因此，選擇DNA(1)包被濃度為40 nmol/L。

2.2.3DAPI用量的優(yōu)化固定親和素包被濃度為50 mg/L，DNA(1)包被濃度為40 nmol/L，在過(guò)量DNA(2)存在時(shí)，與500 nmol/L的 OTC 發(fā)生識(shí)別反應(yīng)形成“發(fā)卡型”雙鏈結(jié)構(gòu)后，分別與不同濃度DAPI(0.01，0.1，10，50 μmol/L)孵育10 min，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示 DAPI 濃度為 10 μmol/L時(shí),461 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度最大，此后隨著DAPI 濃度增加熒光強(qiáng)度不再增加，說(shuō)明此時(shí)反應(yīng)已飽和。因此，DAPI 濃度采用 10 μmol/L。

2.2.4Exo Ⅰ用量的優(yōu)化當(dāng) DNA(1)包被濃度為40 nmol/L，DNA(2)濃度為40 nmol/L時(shí)，未做識(shí)別反應(yīng)，DNA(1)和DNA(2)直接被Exo Ⅰ水解，考察了 Exo Ⅰ 用量分別為0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，1.8 μL(5 U/μL)時(shí)，檢測(cè)體系在461 nm處的熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：隨著Exo Ⅰ用量的增加，體系熒光強(qiáng)度降低，當(dāng)Exo Ⅰ用量增至1.0 μL時(shí)，體系熒光強(qiáng)度降至最低，說(shuō)明此時(shí) Exo Ⅰ 用量已足夠。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇 Exo Ⅰ 的用量為1.0 μL。

圖2　DNA傳感器與不同濃度的OTC作用后的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of DNA sensing system in presence of various concentrations of OTC concentrations of OTC(from a to j):0,10,15,20, 30,40,50,100,200,500 nmol/L； λex=358 nm,λem=461 nm

圖3　461 nm處的熒光強(qiáng)度與OTC濃度的關(guān)系曲線Fig.3　Linear relationship between fluorescence intensity in 461 nm and OTC concentration

2.3線性范圍與檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，測(cè)定不同濃度OTC與適體傳感器作用后的熒光光譜。結(jié)果如圖2 所示，隨著OTC濃度的增加，461 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸增大。根據(jù)461 nm處的光譜數(shù)據(jù)繪制出熒光強(qiáng)度與OTC濃度的關(guān)系曲線(圖3)。結(jié)果顯示，在10～500 nmol/L范圍內(nèi)，隨著體系中OTC 濃度的逐漸增加，溶液的熒光強(qiáng)度迅速增大，之后趨于緩慢。在10～50 nmol/L 范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度(IF)與 OTC 濃度(c,nmol/L)呈良好的線性關(guān)系(圖3插圖)，回歸方程為IF=1 603c+3 593，相關(guān)系數(shù)(r)為0.985 6，檢出限(3σ/n)達(dá)2.3 nmol/L。

考察了10～50 nmol/L濃度范圍內(nèi)，其它四環(huán)素體系熒光強(qiáng)度與其濃度的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在相同條件下，用上述建立的方法測(cè)定四環(huán)素、金霉素和強(qiáng)力霉素時(shí)，在10～50 nmol/L 范圍內(nèi)，體系的熒光強(qiáng)度與濃度也呈良好的線性關(guān)系，線性方程分別為IF=1 579c+3 586，IF=1 586c+3 574和IF=1 629c+3 591，檢出限分別為 2.1，3.2，3.6 nmol/L。由于4種化合物的線性方程相似，為了簡(jiǎn)化處理，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以土霉素為目標(biāo)分子建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線為工作曲線，近似驗(yàn)證該方法的適用性。

2.4回收實(shí)驗(yàn)

選擇自家養(yǎng)魚(yú)廢水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為10，30 nmol/L，四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表1。4種目標(biāo)分析物的平均回收率為88.5%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)為3.2%～6.7%。表明本方法的準(zhǔn)確度和靈敏度良好。同時(shí)養(yǎng)殖廢水中加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果與純水中的加標(biāo)回收數(shù)據(jù)一致,說(shuō)明養(yǎng)殖廢水中可能出現(xiàn)的復(fù)雜成分(鈉、鉀、氯、硫酸鹽、磷酸鹽、銨鹽、鈣離子等無(wú)機(jī)物質(zhì)；尿素、尿激酶、表皮生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)激素等有機(jī)物質(zhì)[16])對(duì)TCs的檢測(cè)無(wú)影響，表明該方法對(duì)TCs的檢測(cè)具有良好的特異性。

表1　回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.5實(shí)際樣本的檢測(cè)

應(yīng)用本方法檢測(cè)錦州北鎮(zhèn)5個(gè)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)(1#，2# 和3# 是養(yǎng)豬場(chǎng),4# 和5# 是養(yǎng)雞場(chǎng))采集的廢水，結(jié)果均檢出四環(huán)素類抗生素殘留，總殘留濃度為7.6～42.7 nmol/L。

3　結(jié)　論

基于核酸適體構(gòu)象變化及 Exo Ⅰ 輔助的信號(hào)放大策略，構(gòu)建了適體熒光傳感器用于TCs總殘留的檢測(cè)。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，熒光強(qiáng)度與TCs濃度在10～50 nmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢出限不高于3.6 nmol/L。該方法簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可滿足養(yǎng)殖場(chǎng)廢水中TCs總殘留量的測(cè)定，同時(shí)滿足大批量樣品和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。適體構(gòu)象變化形成“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)的結(jié)合模式也為其它物質(zhì)的檢測(cè)和傳感器的設(shè)計(jì)提供了新思路。

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Detection of Tetracycline Antibiotics in Aquaculture Wastewaterby DNA-based Fluorescence Assay

ZHAO Qiu-ling*,ZHANG You-hua,YU Xiao-yan

(College of Mining Industry Technology，Liaoning Technical University，Huludao125105，China)

A novel analysis method based on specific recognition of aptamer and fluorescence probe technique was established for the detection of total residues of tetracycline antibiotics(TCs)，including oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline etc.in aquaculture wastewater.Two segments of DNAs work together to identify TCs to fold into a stable “hairpin” double chain structure that can be inserted by nucleic acid dye DAPI to generate of fluorescence emission.Based on this,TCs can be quantified.Under the optimal experimental conditions,the working curve was established with oxytetracycline as target molecule,the fluorescence intensity showed a good linear relationship with concentration of oxytetracycline in the range of 10-50 nmol/L,and the detection limit of oxytetracycline was 2.3 nmol/L.When having oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline as additives,the average recoveries ranged from 88.5% to 102.3%,with relative standard deviations(n=5) of 3.2%-6.7%.The method is simple,sensitive and rapid,and could satisfy the requirements for determination of total TCs residues in the farm wastewater.

aptamer；fluorescence analysis；tetracyclines；rapid detection；wastewater

2016-01-31；

2016-02-18

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21506087)

趙秋伶，博士，講師，研究方向：化學(xué)生物學(xué)與食品安全分析，Tel:0429-5310568，E-mail:flyzhql@iccas.ac.cn

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.07.016

O657.6；R978.1

A

1004-4957(2016)07-0869-05