陳德文，侯楊璐，劉宣邑，陳梅蘭（.國家日用小商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江義烏 3000； .浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 3005）

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超聲萃取高效液相色譜法測定指畫顏料中的6種防腐劑*

陳德文1，侯楊璐2，劉宣邑2，陳梅蘭2
（1.國家日用小商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，浙江義烏 322000； 2.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，杭州 310015）

建立指畫顏料中2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲酸等6種防腐劑的超聲萃取-高效液相色譜的測定方法。經(jīng)試驗確定，萃取溶劑為100%甲醇，萃取時間為10 min，萃取溫度為25℃。采用Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-水為流動相梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為245 nm。在0.5～20 mg/L檢測范圍內(nèi)6種防腐劑的質(zhì)量濃度與其色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)r≥0.999 2，方法檢出限為1.15～1.71 μg/L，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%～3.18%（n=8），加標(biāo)回收率為84.2%～108.0%。該方法操作簡單，靈敏度高，可用于指畫顏料中6種防腐劑含量的分析檢測。

超聲萃?。桓咝б合嗌V法；指畫顏料；防腐劑

為了防止指畫顏料在生產(chǎn)、使用和保存過程中污染而腐敗變質(zhì)，必需添加一種或多種防腐劑。但過量使用防腐劑可能會導(dǎo)致頻繁接觸防腐劑的人體產(chǎn)生過敏等反應(yīng)［1-5］。根據(jù)歐盟玩具標(biāo)準(zhǔn)EN 71-7-2014 《指畫顏料要求和測試方法》的要求，歐盟允許使用的指畫顏料防腐劑物質(zhì)有43種，且每種防腐劑的添加都有限量要求，其檢測方法參照歐盟化妝品指令中有關(guān)防腐劑的測試方法，而指令只涉及到苯甲酸、水楊酸、山梨酸、對羥基苯甲酸和丙酸等幾種防腐劑的分析方法。

根據(jù)現(xiàn)有文獻報道，防腐劑的測定方法有膠束電動色譜法、毛細管電泳法和伏安法等新型檢測方法，還有薄層色譜法、氣相色譜法、吸光光度法、高效液相色譜法［6-12］，如武婷等用反相高效液相色譜法同時測定化妝品中的24種防腐劑［13］。目前我國還沒有玩具指畫顏料中防腐劑的檢測方法，無法滿足玩具指畫顏料行業(yè)健康發(fā)展的需求。筆者采用超聲萃取法，建立了高效液相色譜法測定玩具指畫顏料中2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸正丁酯等6種防腐劑的檢測方法。該方法簡單、準(zhǔn)確，靈敏度高且成本較低，可用于指畫顏料中防腐劑的有效測定。

1　實驗部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200 series型，由高壓六通進樣閥，在線脫氣儀，梯度混合儀和UV-Vis檢測器組成，美國安捷倫科技公司；

三頻恒溫數(shù)控超聲波清洗器：KQ-300GVD型，昆山市超聲儀器有限公司；

臺式低速自動平衡離心機：TDZ5-WS型，長沙湘智離心機儀器有限公司；

電子分析天平：BS-224S型，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，美國天地TEDIA有限公司；

2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸正丁酯標(biāo)準(zhǔn)樣品：德國Bepure有限公司；

實驗用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）。

1.2色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，大連依利特儀器公司）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速：1.0 mL/min；進樣體積：20 μL；柱溫：30℃。

表1　流動相梯度洗脫程序

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：1 000 mg/L，準(zhǔn)確稱取6種防腐劑標(biāo)準(zhǔn)樣品各0.050 0 g（精確至0.1 mg），用甲醇溶解并用50 mL容量瓶定容，儲存于4℃冰箱中備用；

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用甲醇稀釋至濃度分別為0.5，1.0，5.0，10，20 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4樣品前處理

準(zhǔn)確稱取8種顏色的指畫顏料試樣0.1 g，置于10 mL離心管中，并準(zhǔn)確加入10.00 mL甲醇，用玻璃棒充分攪拌溶解，在頻率為45 kHz，溫度為30℃的條件下超聲提取10 min，然后以10 000 r/min離心10 min，移取部分溶液過0.45 μm微孔濾膜后進樣分析。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品萃取方法優(yōu)化

2.1.1提取溶劑

分別采用乙腈和甲醇作為提取溶劑進行試驗，結(jié)果表明，乙腈作為提取劑時，樣品提取液中的雜質(zhì)較多，從而影響色譜檢測效果。用100%的甲醇溶解，離心后的上清液清澈，因此實驗采用100%甲醇作為提取溶劑。

2.1.2萃取時間

分別向樣品中添加質(zhì)量濃度為1，0.5，2.5，4，4，4 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，考察超聲時間為10，15，20，25，30，35，40 min時防腐劑的萃取效率。試驗結(jié)果表明，萃取時間為10 min時防腐劑的提取效率最優(yōu)，因此選擇萃取時間為10 min。

2.1.3提取溫度

分別向樣品中添加質(zhì)量濃度為1，0.5，2.5，4，4，4 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別考察提取溫度為10，15，20，25，30，35，40，45℃時磺胺類藥物的萃取效率。結(jié)果顯示，提取溫度為25℃時回收率最優(yōu)，因此實驗選擇提取溫度為25℃。

2.2色譜條件優(yōu)化

2.2.1色譜柱

分別考察了依利特Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），依 利 特SinoChrom ODSBP（200 mm×4.6 mm，5 μm）和安捷倫TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）3種不同極性色譜柱對防腐劑的分離效果，結(jié)果表明，防腐劑在不同極性色譜柱上的分離選擇性有一定差異，綜合考慮采用Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm， 5μm）進行樣品分離。

2.2.2流動相

分別采用不同比例的甲醇-水、乙腈和磷酸二氫鉀作為流動相進行試驗。結(jié)果表明，采用甲醇-水為流動相時，防腐劑不能較好地分離；用乙腈和磷酸二氫鉀為流動相時，因為有鹽類的存在，很容易把柱子或者管路堵住，導(dǎo)致壓力降低無法繼續(xù)實驗；改用乙腈-水作為流動相進行梯度洗脫時，能獲得理想的色譜峰形和分離效果，因此實驗選擇乙腈-水作為流動相。

2.2.3流動相流速

考察了流動相流速為0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2 mL/min時，6種防腐劑的分離效果。試驗結(jié)果表明，流速過高時峰形過于擁擠，不利于分離；而流速過低時，分析時間延長，峰形變差，最終選擇流動相流速為1.0 mL/min。

2.3方法線性范圍及檢出限

在1.2色譜條件下，將0.5，1，5，10，20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按濃度由低到高的順序依次上機進行測定，以待測物質(zhì)的質(zhì)量濃度（X ）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y ）為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。工作曲線方程，相關(guān)系數(shù)見表2。10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液色譜圖見圖1。

以3倍信噪比（S/N=3）計算方法檢出限，檢出限結(jié)果列于表2。

表2　工作曲線方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

圖1　混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.4精密度試驗

對添加1.00 mg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的試樣溶液重復(fù)進樣8次，結(jié)果見表3。由表3可知，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.54%～3.18%，，說明方法的精密度良好。

表3　精密度試驗結(jié)果

2.5樣品測定及回收試驗

取適量8種顏色的指畫顏料置于10 mL離心管中，用100%甲醇溶解后超聲提取，將提取液離心10 min后用0.45 μm微孔濾膜過膜后進樣分析。另取8種顏色的指畫顏料各3份，分別加入10，5，25，40，40，40 μL的2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮、苯甲酸、4-羥基苯甲酸甲酯、4-羥基苯甲酸乙酯、4-羥基苯甲酸丙酯、4-羥基苯甲酸正丁酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品提取方法提取后，在優(yōu)化的色譜條件下進樣分析，試驗結(jié)果及加標(biāo)回收率見表4。由表4可知，樣品加標(biāo)回收率為84.2%～108.0%，可見所建方法的準(zhǔn)確度較高。

表4　加標(biāo)回收試驗結(jié)果（n=3）

3　結(jié)語

建立超聲萃取-高效液相色譜法測定指畫顏料中防腐劑的方法，方法檢出限低，重現(xiàn)性好，精密度、準(zhǔn)確度滿足分析檢測要求，該方法可用于指畫顏料中防腐劑的有效測定。

［1］ 汪昭君，王瑟，崔娜，等.防腐劑布羅波爾及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對發(fā)光菌的毒性［J］.中國環(huán)境科學(xué)，2008，28（11）: 999-1 003.

［2］ 王文慧，李鄰峰，路雪艷，等.化妝品過敏的常見變應(yīng)原及診斷［J］.中國工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志，2006，19（4）: 223-227.

［3］ 王海濤，何聰芬，董銀卯.化妝品接觸性皮炎的發(fā)病機理探究［J］.香料香精化妝品，2008，36（5）: 23-26.

［4］ 楊艷偉，劉思然，羅嵩，等.化妝品中防腐劑使用情況調(diào)查［J］.環(huán)境衛(wèi)生學(xué)雜志，2012，2（2）: 56-59.

［5］ 王萍，李潔，王潤婷.國產(chǎn)化妝品中防腐劑含量的調(diào)查［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2015，25（21）: 3 752-3 753.

［6］ 朱俐，劉洋，曾三平，等.化妝品中有害物質(zhì)分析檢測方法研究進展［J］.分析測試學(xué)報，2016，35（2）: 185-193.

［7］ 王友升，朱昱燕，董銀卯.化妝品用防腐劑的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢［J］.日用化學(xué)品科學(xué)，2007，30（12）: 15-18.

［8］ 莊曉梅，趙冬梅，韓淑琴，等.化妝品防腐劑及其檢測技術(shù)研究進展［J］.日用化學(xué)品科學(xué)，2011，34（11）: 38-42.

［9］ 查玉安，趙亞華.高效液相色譜法測定化妝品中7 種防腐劑［J］.職業(yè)與健康，2002，18（4 ）: 47-48.

［10］ 白艷玲，張彩虹，陳劍剛.化妝品8 種防腐劑同時測定的氣相色譜法［J］.環(huán)境與健康雜志，2004，21（3）: 170-171.

［11］ 馮靚，應(yīng)英，譚瑩，等.高效液相色譜法同時測定化妝品中的12種防腐劑［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2010，20（9）: 2 171-2 173.

［12］ 戴京晶，劉奮，梁偉，等.氣相色譜法分析化妝品中的防腐劑［J］.實用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，12（4）: 738-740.

［13］ 武婷，王超，王星，等.反相高效液相色譜法測定化妝品中的24種防腐劑［J］.分析化學(xué)，2007，35（10）: 1 439-1 443.

Determination of Six Preservatives in Finger Paints by Ultrasonic Extraction-High Performance Liquid Chromatography

Chen Dewen1， Hou Yanglu2， Liu Xuanyi2， Chen Meilan2
（1. National Center of Quality Supervision and Inspection for Commodity， Yiwu 322000， China；2. College of Biology and Environment Engineering， Zhejiangshuren University， Hangzhou 310015， China）

A method for determination of six preservatives compounds such as 2-methyl-4-isothiazolin-3-one， benzoic acid， etc. in finger paints by ultrasonic extraction-high performance liquid chromatography was developed. The extraction solvent was 100% methanol，extraction time was 10 min and extraction temperature was 25℃. The chromatographic separation was carried out on Hypersil ODS column （250 mm×4.6 mm，5 μm）. Mobile phase was acetonitrile-water for gradient elution with flow rate of 1.0 mL/min. The wavelength of UV for the HPLC detection was set at 245 nm. The consentration of six preservatives was linear with its chromatographic peak area in the detection range of 0.5-20 mg/L， the correlation coefficent was not less than 0.999 2. The detection limit of the method was 1.15-1.71 μg/L， the relative standard deviation of detection results was 1.54%-3.18%（n=8）， the addition recoveries were 84.2%-108.0%. The method is simple to operate with higher sensitivity， it is suitable for the determination of six preservatives in finger paints.

ultrasonic extraction； high performance liquid chromatography； finger paints； preservative

O657.7

A

1008-6145（2016）04-0043-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.04.011

*浙江省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督系統(tǒng)科研計劃項目（20150272）

聯(lián)系人：陳德文；E-mail: 42030692@qq.com

2016-05-6