賈寶遷 肖艷 王營 任麗麗 王健偉

作者單位：100730中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

2013-2015年人冠狀病毒OC43基因型分布特點的研究

賈寶遷 肖艷 王營 任麗麗 王健偉

作者單位：100730中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所

目的 研究人冠狀病毒（Human Coronavirus，HCoV）OC43的基因型分布特點，為闡明HCoV-OC43的分子流行規(guī)律提供數(shù)據(jù)參考。方法 從2013年-2015年HCoV-OC43檢測陽性的呼吸道樣本中提取核酸，用逆轉(zhuǎn)錄方法擴增cDNA，利用特異性引物擴增全長纖突蛋白基因（S）、聚合酶基因（RdRp）和核蛋白基因（N）。用Mega 6.0軟件進行序列拼接、進化樹構(gòu)建和S蛋白氨基酸比對。結(jié)果 從16份HCoV-OC43陽性樣本中獲得全長S、RdRp和N基因。其中2013年的1株為D基因型，2014年的8株均為D基因型，2015年的7株中包括3株B、3株D和1株E（CH）基因型。B和D基因型的S蛋白分別有9個和16個氨基酸位點的突變與分離年份有關(guān)，B基因型中氨基酸突變呈累加現(xiàn)象，D基因型中出現(xiàn)連續(xù)突變和回復(fù)突變。結(jié)論 HCoV-OC43表現(xiàn)為多基因型共流行，D基因型高流行?？乖鞍譙的氨基酸突變在各基因型流行中起重要作用。本研究為完善和豐富對HCoVOC43的分子流行特征的認識提供了數(shù)據(jù)參考。

【主題詞】 人冠狀病毒OC43；基因型；突變；流行

Fund programs：Nationa1 Major Science&Techno1ogy Project for＂Contro1 and Prevention of Major Infectious Diseases of China＂ （2012ZX10004206）；New Century Exce11ent Ta1ents in University （3332013127）

人冠狀病毒（Human Coronavirus，HCoV）是常見的呼吸道病毒，為巢病毒目冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，是有包膜的單股負鏈RNA病毒［1］。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的六種HCoV（229E、NL63、OC43、HKU1、SARSCoV和MERS-CoV）中，HCoV-OC43在人群中的檢出頻次最高，且由于其從1967年就被發(fā)現(xiàn)，是用于研究HCoV分子流行特點的重要模型［1，2］。HCoVOC43基因組全長約30.7 kb。編碼包含16個非結(jié)構(gòu)蛋白的開放閱讀框架1ab、ORF2a、血凝素-酯酶蛋白、纖突蛋白（Spike，S）、ORF5a、小囊膜蛋白、膜蛋白和核衣殼（Nuc1eocapsid，N）蛋白［1］。其中抗原基因S、聚合酶RdRp和N蛋白的基因是HCoV進化分析的主要功能基因［2-4］。

基因重組和基因突變是病毒進化采用的兩種策略［5］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn) HCoV-OC43有多種基因型［2-4，6］，由重組產(chǎn)生的新基因型不斷出現(xiàn)［2，3，6］?；谌L的S、RdRp和N基因的分型研究表明，有A、B、C、D、E（中國命名，CH）和E（法國命名，F(xiàn)R）6個基因型及 F和 G分枝［2-4］。前期對我國 2005-2012年的HCoV-OC43的研究發(fā)現(xiàn)存在B、C、D基因型共流行，在2010年后出現(xiàn)重組產(chǎn)生的新 E （CH）基因型［2］。上述發(fā)現(xiàn)對初步闡釋HCoV-OC43的流行趨勢提供了重要參考，而明確病毒的流行規(guī)律還需要更長的研究時間和更多的基因序列信息。因此，我們對2013年至2015年流行的HCoV-OC43開展了進化分析，以完善和豐富對其分子流行特點的認識。

1 材料與方法

1.1樣本來源 HCoV-OC43陽性的呼吸道樣本來自2013年至2015年采集自北京兒童醫(yī)院、北京協(xié)和醫(yī)院、深圳市第三人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的呼吸道感染病例，樣本采集均具備知情同意。

1.2核酸提取與基因擴增 用easyMAG全自動核酸提取儀（法國生物梅里埃）提取總核酸，最終洗脫體積為55μ1。取6μ1總核酸為模板，用SuperScriptTMIII逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、隨機引物pN（6）和O1igod（T）（美國Invitrogen產(chǎn)品）進行逆轉(zhuǎn)錄。取1 μ1 cDNA為模板進行PCR擴增。擴增S、RdRp和N基因的特異性引物及PCR反應(yīng)條件參考Zhang等的報道［2］。PCR擴增產(chǎn)物進行直接測序或者克隆測序。

1.3全基因組序列的拼接與進化分析 獲得的測序序列在MEGA（版本6.0）軟件中進行拼接，以GenBank中發(fā)表全序列為參考，牛冠狀病毒（Bovincoronavirus，BCoV）mebus株為外源序列構(gòu)建進化樹［7］。

1.4氨基酸突變位點分析 將本研究獲得的S蛋白氨基酸序列按照基因型分組，與GenBank中發(fā)表的序列用MEGA（版本6.0）中C1usta1W比較分析S蛋白氨基酸突變情況。B和D基因型氨基酸位點參比株分別為 87309-BE03（AY903459）和 HK04-02 （JN129835）。

2 結(jié)果

2.1基因擴增結(jié)果 通過對研究期間HCoV-OC43病例樣本的基因擴增，從其中16例病例樣本中獲得S、RdRp和N全基因序列，病例年齡分布1個月～64歲。病例的各年分布分別為2013年1例，2014 年8例，2015年 7例。序列 GenBank編號為KU745533-KU745580。

2.2序列進化分析 將獲得的S、RdRp和N基因與GenBank中發(fā)表的參考基因序列進行比對，以BCoV Mebus株為外源序列構(gòu)建了進化樹。如圖1所示，在S基因進化樹上，本研究分離的3株HCoVOC43毒株與已知的B基因型位于同一進化分枝，12株與已知的D基因型進化關(guān)系較近，1株與本課題組前期發(fā)現(xiàn)并命名的E（CH）基因型進化關(guān)系較近。基于N和RdRp基因的進化分析結(jié)果與S基因的結(jié)果相似。

2.3各基因型年分布特點 為進一步明確各基因型的年度分布特點，將明確分型的16株樣本按采集年份繪圖。如圖2所示，2013年的1例和2014年的8例均為D基因型，2015年的7例分別為3例B、3 例D和1例E（CH）基因型。

2.4S蛋白氨基酸位點的突變分析 在B基因型中，與 2003年首次鑒定的毒株 87309-BE03 （AY903459）比較，其后獲得的毒株S蛋白有9個氨基酸位點突變與分離年份相關(guān)。如表1所示，2004年后毒株均出現(xiàn)L69I突變，2006年后增加R34I和F481L，2008年后增加F31L，2010年后增加K184N、D266N和E805D，2012年的毒株增加了N470D和L504S。在各年分離的D基因型有16個位點的氨基酸突變與分離年份相關(guān)。如表2所示，與2004年的HK04-02（JN129835）比較，其后分離的毒株序列有4個氨基酸位點出現(xiàn)連續(xù)突變，包括L/R265P、G/Y/H521S、P/F535L和C/T546S；4個位點為回復(fù)突變N/D33N、T/K93T、D/H120D和L/S195L；8個位點為單向突變，包括 P22T、P38L、K90L、K184N、S263R、D266K、I267D和T276S。

●本研究獲得的毒株圖1　HCoV-OC43 S、N和RdRp基因進化樹●Strains in this studyFig.1 Phy1ogenetic trees of HCoV-OC43 S，N and RdRp genes

圖2　HCoV-OC43陽性樣本基因型時間分布Fig.2 Genotype distributions of HCoV-OC43 over time

3 討論

HCoV-OC43基因遺傳多樣性首次于2005年由比利時的研究小組報道［6］。2011年Lau等首次用2004-2011年在中國香港收集的29株HCoV-OC43病例樣本將HCoV-OC43分為A-D 4個基因型，2004年出現(xiàn)基因重組來源的D基因型［3］。本課題組前期對我國2005-2012年北京等地區(qū)采集的65株序列的研究，發(fā)現(xiàn)存在B、C和D基因型的共流行，2010年出現(xiàn)重組產(chǎn)生的新E基因型［2］。隨后，Kin等對2001-2013年15株來自美國和法國的序列分析，提出存在E基因型，基于RdRp和N基因分析提出存在F和G分枝［4］。但Kin等提出的E（FR）基因型與基于我國樣本發(fā)現(xiàn)的E（CH）基因型毒株序列并不在同一個進化分枝上。本研究結(jié)果表明我國2013-2015年的HCoV-OC43仍為B、D和E（CH）基因型。這與已有的研究結(jié)果一致［2］，提示近年我國HCoV-OC43基因型的穩(wěn)定流行。

抗原基因S氨基酸突變在HCoV-OC43流行中具有重要作用［7］。以往研究發(fā)現(xiàn)B基因型中也存在S蛋白氨基酸的突變［7］?；诒狙芯吭黾拥?015年B基因型序列，進一步明確在S1區(qū)域氨基酸突變位點隨分離年份呈逐年累加的特點。在D基因型中發(fā)現(xiàn)已有報道的N33D、K90L和K184N仍存在2013年后的D基因型中［7］，但是93、120和195位出現(xiàn)回復(fù)突變，而521位點由Y/H連續(xù)突變到S，263R和265P僅在2015年后的D基因型中檢測到，D基因型中的回復(fù)突變和連續(xù)突變在以往的研究中未見報道。上述從B和D基因型中發(fā)現(xiàn)的氨基酸突變位點和特征，對深入探討S基因在CoV進化中的突變?nèi)萘繕O限提供了重要的數(shù)據(jù)參考。

對HCoV-OC43遺傳多樣性的研究報道來自多個國家和地區(qū)，但各基因型或分枝的出現(xiàn)具有明顯的時間分布特征，包括E（FR）1983-2005年，F(xiàn)1995-1996年，B2003-2006年/2010-2015年，C2004-2006年，D2004-2015年，E（CH）2010-2015年，G2012年［2-4，6，7］。表明HCoV-OC43在全球具有相似的分子流行特征。本研究關(guān)于基因型分布特點的分析為完善和豐富對HCoV-OC43的分子流行特征的認識提供了數(shù)據(jù)參考。

表1　不同時間分離的B基因型S蛋白氨基酸位點突變分析Tab.1 Amino acids mutations of S protein for B genotype over time

表2　不同時間分離的D基因型S蛋白氨基酸位點突變分析Tab.2 Amino acids mutations of S protein for D genotype over time

致謝：感謝首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院、深圳市第三人民醫(yī)院和哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的臨床工作人員協(xié)助采集臨床樣本。

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The characteristics of genotype distributions for human coronavirus OC43 between 2013 to 2015

JiaBaoqian，Xiao Yan，Wang Ying，Ren Lili，Wang Jianwei Institute of Pathogen Biology，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China

Ren Lili，Email：renliliipb@163.com

Objective To identify the characteristics of HCoV-OC43genotype in recent years. Methods Nuc1eic acids were extracted from HCoV-OC43-positive respiratory specimens co11ected from 2013 to 2015.The cDNA were generated by reverse transcription.Specific primers were used to amp1ify the fu11 1ength of spike（S），RNA dependent RNA po1ymerase（RdRp）and Nuc1eocapsid（N）genes.The sequences assemb1ing，phy1ogenic ana1yzing and amino acids a1ignments were performed by using Mega 6.0 software.Results The genes were successfu1 amp1ified from 16 HCoV-OC43 c1inica1 samp1es.Of the 16 strains，1 from 2013，a11 8 from 2014 and 3 from 2015 be1onged to genotype D，and 3 from 2015 be1onged to genotype B，and 1 from 2015 be1onged to genotype E named by China，E（CH）.The coding po1ymorphisms were found in S protein，with 9 sites in B and 17 sites in D genotypes were between chrono1ogica11y distinct strains.Accumu1ations of amino acids mutations were observed during the evo1ution of B genotype，whi1e reverse and successive changes were found in D genotypes.Conclusions Mu1tip1e genotypes of HCoVOC43 co-circu1ated，with dominant epidemic of D genotype.The genetic drift in S gene p1ays an important ro1e in the epidemic of specific genotype of HCoV-OC43.Our resu1ts provide insights to c1arify the mo1ecu1ar epidemic characteristics of HCoV-OC43.

Human Coronavirus OC43；genotype；mutation；epidemic

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項（2012ZX10004206）；協(xié)和青年基金和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助（3332013127）

任麗麗，Emai1：ren1i1iipb@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.016

2016-02-24）