趙悅，孫慶元，孫琦（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

研究開發(fā)

橘黃酮的提取及其抑菌特性

趙悅，孫慶元，孫琦
（大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

采用乙醇浸提法從橘子皮中提取黃酮，通過正交試驗(yàn)確定提取的最佳條件為：70%乙醇為提取劑，固液比為1︰20（g/mL），提取溫度是70℃，提取時(shí)間2h，在510nm處測定橘黃酮質(zhì)量濃度為0.205g/L，從橘子皮中提取的黃酮干重得率為2.938mg/g。本實(shí)驗(yàn)探究橘黃酮的抑菌活性，采用牛津杯法測抑菌作用，結(jié)果表明，橘黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌均有抑制作用，銅和鎂離子可分別增強(qiáng)橘黃酮對細(xì)菌和真菌的抑菌作用，低pH和低溫可提高抑菌效果，且優(yōu)化pH和溫度的橘黃酮?jiǎng)┬徒档土俗钚∫志鷿舛龋∕IC）20%，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌的抑菌作用分別提高了17%、27%、25%、28%、19%，高于對氯間二甲苯酚和甲基托布津的抑菌作用，特別是高于對細(xì)菌的抑菌作用。

浸取；橘皮；黃酮；抑菌；優(yōu)化；生物技術(shù)

柑橘加工產(chǎn)生了大量的柑橘皮渣，占鮮重的40%～50%［1］。柑橘皮渣除含有水分、纖維素、木質(zhì)素外，還含有豐富的香精油、果膠、色素和類黃酮等生物活性物質(zhì)，其綜合利用價(jià)值極高［2］。目前，大多數(shù)研究機(jī)構(gòu)對黃酮的研究重點(diǎn)還是在抗氧化性上面［3］，例如對超氧陰離子的去除作用、對羥自由基的清除作用、對抗癌癥［4］，還有一些黃酮類化合物的合成［5］，而在抑菌方面的研究少有報(bào)道。本研究采用低毒的乙醇浸提法［6-7］，雖然該法比較陳舊，但在本研究中提取率高，且避免使用高污染溶劑，工藝簡單，生產(chǎn)成本低，提取純化過程中乙醇還可以回收利用，節(jié)約環(huán)保。實(shí)驗(yàn)選擇最佳的提取方案，并研究橘皮黃酮類化合物抗細(xì)菌和真菌的作用，同時(shí)考察pH、溫度、金屬離子對黃酮類化合物抑菌效果的影響。將橘黃酮調(diào)節(jié)到最佳pH和溫度作為優(yōu)化劑型。橘黃酮是從橘皮中提取的，屬天然物質(zhì)，因此試圖將橘黃酮應(yīng)用于食品的保鮮防腐中［8］，還可作為有機(jī)環(huán)保溫室蔬菜大棚的抑菌劑，既可以使橘皮得到高效利用，又可以抑菌防腐。

1　實(shí)驗(yàn)方法

1.1材料和儀器

材料：橘皮、蕓香葉苷、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖，購自北京奧博星生物有限公司。

菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉，來自大連工業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室；灰葡萄孢菌和黃枝孢菌，為野外純化得到。

儀器：722型可見光分光光度計(jì)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52，上海亞榮；pH計(jì)PHS-3C，上海越平。

1.2橘黃酮的提取及含量測定

首先選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為0、20%、40%，60%、80%提取橘黃酮，獲得最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)；在最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)下，選擇橘皮粉末與乙醇溶劑固液比（g/mL）為1︰5、1︰10、1︰15、1︰20、

1︰25取橘黃酮，獲得最佳固液比。在最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)和固液比下，選擇提取溫度分別為 40℃、50℃、60℃、70℃、80℃提取橘黃酮，獲得最佳溫度。在最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比和溫度下，選擇提取時(shí)間分別為1h、2h、3h、4h、5h，獲得最佳提取時(shí)間。分別測定總黃酮的質(zhì)量濃度。

根據(jù)以上4個(gè)因素，采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表，以提取的橘黃酮的吸光度值為指標(biāo)來確定最佳提取條件，將橘皮粉末按最佳提取條件浸提過濾［3］，80℃下旋蒸，所得到的液體即為橘黃酮。

以分析純蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y為吸光度，X為蘆丁濃度，Y=12.12X - 0.02，R2=0.995，在 8.0～ 48.0mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

式中，ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出提取液中黃酮類化合物的質(zhì)量濃度，mg/L；V為提取液體積；mt為橘皮總質(zhì)量，g。

1.3橘黃酮抑菌作用的測定

將所得橘黃酮按20%、40%、60%、80%、100%比例進(jìn)行稀釋，分別取橘黃酮稀釋液2mL與18mL固體培養(yǎng)基混合，倒入平皿中。再分別吸取1.0×106金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌菌懸液 100μL［9］，涂布，培養(yǎng)，測定最小抑菌濃度（MIC）。

向平皿中倒一薄層固體培養(yǎng)基，凝固后放牛津杯，再倒一層固體培養(yǎng)基，凝固后將牛津杯取出，用移液槍吸取菌懸液100μL，涂布平板，再吸取橘黃酮100μL加到小孔中，培養(yǎng)，即為牛津杯法。

將橘黃酮的pH分別調(diào)整到3.0、3.5、4.0、4.5、5.0［10］，按牛津杯法培養(yǎng)，分別測定橘黃酮的抑菌圈直徑，以對應(yīng)的pH去離子水為對照。

在最佳抑菌pH下，按牛津杯法將細(xì)菌和真菌的分別在29℃、31℃、33℃、35℃、37℃、39℃、41℃和21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃培養(yǎng)，分別測定橘黃酮的抑菌圈直徑。

在最佳抑菌pH和溫度下，按牛津杯法向每個(gè)小孔中分別加入50μL 0.2mol/L的CuSO4、MgSO4、MnSO4溶液，分別測定橘黃酮的抑菌圈直徑。

將橘黃酮調(diào)節(jié)到上述實(shí)驗(yàn)得到的最佳溫度和pH作為優(yōu)化劑型。

取2%對氯間二甲苯酚和1%甲基托布津，按牛津杯法，分別測定這兩種抑菌劑的抑菌圈直徑。

實(shí)驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)。

2　結(jié)果與討論

2.1影響橘黃酮提取因素的分析

根據(jù)1.2節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟獲得各因素與橘黃酮提取量的關(guān)系，結(jié)果見圖1。由圖1（a）可見，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增高，橘黃酮的提取量也增高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，橘黃酮質(zhì)量濃度為最高 0.164 g/L，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，橘黃酮質(zhì)量濃度有所降低，可能是由于隨著乙醇含量增高，浸出的物質(zhì)也更多。由圖1（b）可見，隨固液比增高，橘黃酮提取量也增高，當(dāng)固液比為 1∶15（g/mL）時(shí)，橘黃酮提取量達(dá)到最高0.170g/L，固液比再增加，橘黃酮的提取量卻有所下降。由圖1（c）可見，隨溫度升高，橘黃酮提取量增高，在50～70℃之間并無太大差異，在60℃時(shí)橘黃酮質(zhì)量濃度為最高0.177g/L，隨后下降。由圖1（d）可見，隨時(shí)間增加，提取的橘黃酮濃度增高，長時(shí)間的浸提可以讓橘黃酮更好的浸出，當(dāng)4h時(shí)，橘黃酮質(zhì)量濃度為最高0.181g/L，而當(dāng)5h時(shí)，已經(jīng)無法浸出更多活性物質(zhì)。

圖1　不同因素對橘黃酮提取效果的影響

2.2橘黃酮的最佳提取因素的分析

表1為影響橘黃酮因素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析。A、B、C、D分別表示乙醇體積分?jǐn)?shù)、固液比、溫度、時(shí)間。通過極差分析可得，各因素對提取率影響的主次因素為A＞B＞C，C與D的影響主次相同，優(yōu)方案為A3B3C3D2。最終確定橘黃酮提取的最佳條件為：70%乙醇為提取劑，固液比為1︰20（g/mL），提取溫度是70℃，提取時(shí)間2h。橘黃酮質(zhì)量濃度為0.205g/L，得率為2.938mg/g。乙醇回收率可達(dá)94.05%。

表1　影響橘黃酮因素的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及極差分析

2.3橘黃酮抑菌作用的分析

按1.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟分析橘黃酮的抑菌作用，結(jié)果如圖 2～圖 4。從圖 2可以看出，橘黃酮在pH較低時(shí)，抑制細(xì)菌和真菌的作用較低，當(dāng)橘黃酮在pH為3.5～4時(shí)，抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的作用最強(qiáng)，抑制黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌的作用最強(qiáng)。隨著 pH增加，抑制細(xì)菌的作用開始減弱。這可能是由于細(xì)菌的細(xì)胞壁大多是由肽聚糖構(gòu)成，而絲狀真菌的細(xì)胞壁中幾丁質(zhì)含量很高，細(xì)菌和有絲真菌中細(xì)胞壁構(gòu)成的主要成分對pH的耐受性不同，導(dǎo)致了最適抑菌pH不同［11］。

從圖3可以看出，橘黃酮抑制細(xì)菌（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）的最佳溫度為31～33℃，抑制真菌（黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌）的最佳溫度為27～29℃。

圖2　不同值對橘黃酮抑菌作用的影響

圖3　不同溫度對橘黃酮抑菌作用的影響

從圖4看出，橘黃酮加入了金屬離子后，金屬離子不同程度地提高了橘黃酮的抑菌作用。其中銅離子提高橘黃酮的抑菌作用最大，與鎂離子相比提高了143%～216%，與錳離子相比提高了49%～133%。對于絲狀真菌來說，錳離子提高橘黃酮的抑菌作用比鎂離子的大，對黑曲霉、灰葡萄孢菌、黃枝孢菌分別提高了119%、95%、112%。

圖4　不同離子對橘黃酮抑菌作用的影響

2.4優(yōu)化劑型橘黃酮的抑菌作用的分析

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)可以得出橘黃酮的最佳抑菌 pH 為3.5～4，最佳抑菌溫度為27～29℃。將橘黃酮調(diào)整到最佳抑菌pH和最佳抑菌溫度下，作為優(yōu)化劑型測試橘黃酮對5種細(xì)菌的抑菌作用，以橘黃酮最初提取出來的初始pH和初始溫度作為對照。結(jié)果見圖5～圖7。

從圖5可以看出，除了對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度未發(fā)現(xiàn)降低外，優(yōu)化劑型的橘黃酮比對照組的最低抑菌濃度都有所降低。 優(yōu)化劑型的橘黃酮對大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌和黃枝孢菌的最低抑菌濃度均下降了20%。

橘黃酮對細(xì)菌與真菌均有抑菌作用，對細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)于對絲狀真菌的抑菌作用，這可能與細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)構(gòu)成不同有關(guān)［11］。

圖5　優(yōu)化劑型的橘黃酮最低抑菌濃度的分析

圖6　橘黃酮優(yōu)化劑型的抑菌能力分析

圖6是橘黃酮優(yōu)化劑型的抑菌能力分析。從圖6看出，優(yōu)化劑型的橘黃酮的抑菌能力比對照組的也提高了，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黃枝孢菌分別提高了17%、27%、25%、28%、19%。

圖7　橘黃酮與其他殺菌劑的抑菌能力對比分析

圖7是橘黃酮與其他殺菌劑的抑菌能力對比分析。從圖7可以看出，與對氯間二甲苯酚相比，優(yōu)化劑型橘黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黃枝孢菌的抑菌作用分別提高了24%、57%、19%、11%、4%；與甲基托布津相比，對這些菌的抑菌作用分別提高了41%、105%、29%、9%、6%。

3　結(jié)　論

乙醇浸提法從橘子皮中提取黃酮類化合物的最佳條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，固液比1︰20（g/mL），溫度70℃，浸提時(shí)間2h，在510nm下測得所提取的提取液中黃酮含量為 0.205g/L，得率為2.938mg/g，乙醇回收率可達(dá) 94.05%。本研究提取的橘黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黃枝孢菌均有抑菌作用，對細(xì)菌的抑菌作用強(qiáng)于絲狀真菌，橘黃酮抑菌作用與其本身濃度成正比。在低pH和低溫情況下，橘黃酮抑菌作用強(qiáng)，優(yōu)化pH和溫度的橘黃酮?jiǎng)┬徒档土俗钚∫志鷿舛龋∕IC），除金黃色葡萄球菌以外，對大腸桿菌、黑曲霉、灰葡萄孢菌、黃枝孢菌的MIC均降低20%。與銅離子相協(xié)同，抑菌作用得到很大提升。本研究所提取的橘黃酮的抑菌作用高于同類殺菌劑對氯間二甲苯酚和甲基托布津，尤其是對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌。

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Extraction of flavonoids from Citrus reticulate and their antimicrobial characteristics

ZHAO Yue，SUN Qingyuan，SUN Qi
（School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

The flavone compounds were extracted from citruspeels with a modified ethanol extraction method. The optimum extraction conditions were determined by orthogonal tests as：70% ethanol as extractant with solid to liquid ratio 1︰20（g/mL） at 70℃ for 2 hours. The concentration of the flavone compounds were determined with a spectrophotometer at λ=510nm. The results showed that the yield of flavone compounds to the raw materials reached 2.938mg/g，and the ethanol recovery could be up to 94%. The antimicrobial features were also studied. The inhibition of the extracted flavonoids against the growth of Staphylococcus aureus，E. coli，Botrytis cinere，and Cladosporiumfulvum was found，and copper and magnesium ions could enhance the inhibition function on bacteria and fungus respectively. In addition，pH and temperature of the flavonoids could affect the inhibition efficiency. The minimum inhibition concentration（MIC）was reduced by 20% with the ideal formulation of the extracted flavonoids，and the inhibition capabilities against Staphylococcus aureus，E. coli，Aspergillus niger，Botrytis cinere，and Cladosporiumfulvum were increased by 17%，27%，25%，28%，19% respectively under acidic pH and suitable temperature. The inhibition capabilities of the extracted flavonoids against bacteria and fungus，particularly against bacteria，were higher than those of chloro 3，5-dimethylphenol p-chloro-m-xylenol and thiophanate-methyl at the equivalent concentration.

leaching；citruspeel；flavone；inhibition；optimization；biotechnology

Q 936

A

1000-6613（2016）08-2528-05

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.08.35

2015-12-07；修改稿日期：2016-01-14。

趙悅（1990—），女，碩士研究生。聯(lián)系人：孫慶元，教授。E-mail qsun@dlpu.edu.cn。