張高麗，張　弋，于海川，張新雅

(1.河南省周口市中心血站　466000；2.四川成都軍區(qū)總醫(yī)院，成都 610083；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

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利培酮抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化

張高麗1，張弋2，于海川3，張新雅3

(1.河南省周口市中心血站466000；2.四川成都軍區(qū)總醫(yī)院，成都 610083；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

目的研究利培酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。方法采用經(jīng)典的激素雞尾酒法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，油紅O染色觀察。向誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入利培酮研究其對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響。結(jié)果用激素雞尾酒法成功地將3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的脂肪細(xì)胞。0.1、1、10 μmol/L的利培酮均能夠抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。結(jié)論利培酮能夠抑制3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化。

利培酮；3T3-L1細(xì)胞；分化

利培酮屬于第2代抗精神病藥物，也是目前臨床上治療精神分裂癥的一線藥物。長期使用該藥物，會導(dǎo)致體質(zhì)量增加、糖尿病、高血脂等不良反應(yīng)。隨著肥胖發(fā)生率的逐年增加，代謝綜合征已成為一個(gè)全球性的流行病，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是在發(fā)展中國家其發(fā)病率呈逐年升高趨勢。本研究利用3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)為成熟的脂肪細(xì)胞的方法，加入利培酮藥物后，從細(xì)胞水平分析該藥物對脂肪細(xì)胞分化的影響。

1　材料與方法

1.1主要試劑3T3-L1前脂肪細(xì)胞由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；油紅O染液(Oil red染液) 購自廣州威佳科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；胰島素(Insulin)購自Blotopped公司；地塞米松(Dex)購自Blotopped公司；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)購自Sigma公司；利培酮購自Blotopped公司；二甲基亞砜(DMSO)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞用含10%的胎牛血清、Hyclone DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天傳代1次，細(xì)胞貼壁生長，生長良好。

1.2.2細(xì)胞誘導(dǎo)分化采用經(jīng)典的激素雞尾酒方法誘導(dǎo)3T3-L1前脂肪細(xì)胞為成熟的脂肪細(xì)胞。具體步驟如下：3T3-L1前脂肪細(xì)胞生長至完全融合后2 d(即誘導(dǎo)分化0 d)，加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ(含59 mL的10%FBS+600 μL IBMX+200 μL Insulin+60 μL Dex+140 μL DMEM補(bǔ)齊到60 mL)，2 d后換成誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ(含59 mL的10%FBS+200 μL Insulin+800 μL DMEM補(bǔ)齊到60 mL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后換成10%DMEM培養(yǎng)基，2 d換液一次，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 d(即誘導(dǎo)分化8～10 d)，倒置顯微鏡下，觀察3T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)前后的細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3油紅O染色后抽提脂滴半定量測定脂滴油紅O染色后，脂滴半定量的方法檢測定量脂滴中攜帶油紅O的多少。檢測步驟如下：先用PBS洗2次,隨后用4%的多聚甲醛固定15 min；用PBS洗2次，用油紅O染色，室溫密閉染色20 min；染色完成后分別用PBS和60%異丙醇洗滌1次；然后往中皿加入含4%SDS的60%異丙醇4 mL，室溫20 min(期間可緩慢搖晃，有助于加速油紅O溶解于異丙醇)，鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)油紅O是否抽提完全；最后將抽提的油紅O轉(zhuǎn)移至新的離心管，選擇510 nm處用分光光度計(jì)讀取吸光度值。

1.2.4藥物干預(yù)細(xì)胞誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化步驟如同上述經(jīng)典的激素雞尾酒方法，不同的是在加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ和Ⅱ時(shí)，分別加入0.1、1、10 μmol/L利培酮藥，同時(shí)設(shè)置空白組和DMSO組。

2　結(jié)　果

2.13T3-L1細(xì)胞誘導(dǎo)前后的形態(tài)觀察在倒置顯微鏡下(20×)觀察，3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭形，纖維狀貼壁生長。誘導(dǎo)分化第4天，細(xì)胞出現(xiàn)融合逐漸變圓，成功誘導(dǎo)分化后的3T3-L1細(xì)胞，胞內(nèi)有空泡，形成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)。見圖1。

2.2油紅O染色后抽提脂滴半定量測定脂滴半定量結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1細(xì)胞脂滴數(shù)吸光度(OD)值為(0.449±0.003)，3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂滴數(shù)OD值(1.356±0.090)，兩者比較，誘導(dǎo)分化成熟的3T3-L1細(xì)胞脂滴數(shù)增多較明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

注：a為3T3-L1前脂肪細(xì)胞；b為3T3-L1誘導(dǎo)分化第4天；c為成熟的脂肪細(xì)胞。

圖13T3-L1細(xì)胞的誘導(dǎo)分化

2.3藥物干預(yù)細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 選用0.1、1、10 μmol/L濃度的利培酮藥物對3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的干預(yù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化的第5天，各組之間整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，DMSO組細(xì)胞中的脂滴數(shù)比空白組明顯減少(P<0.01)，0.1 μmol/L藥物組、1 μmol/L藥物組、10 μmol/L藥物組細(xì)胞中的脂滴比DMSO組明顯減少(P<0.01)。見圖2、3。

注：a為空白組；b為DMSO組；c為0.1 μmol/L藥物組；d為1 μmol/L藥物組；e為10 μmol/L藥物組。

圖2利培酮組油紅O染色(20×)

注：與空白組比較，*P<0.01。

圖3利培酮藥對3T3-L1前脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

3　討　論

3T3-L1前脂肪細(xì)胞來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，能夠分化為成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞分化是指細(xì)胞內(nèi)沒有脂滴的前脂肪細(xì)胞定向分化為細(xì)胞內(nèi)充滿脂滴的脂肪細(xì)胞的過程[1]。本研究中3T3-L1前脂肪細(xì)胞在誘導(dǎo)分化過程中，細(xì)胞停止有絲分裂、形狀逐漸變大變圓，成“戒環(huán)”樣結(jié)構(gòu)。誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化與文獻(xiàn)[2-4]報(bào)道一致。

第2代抗精神病藥物通過多種途徑導(dǎo)致患者體質(zhì)量增加，加重了胰島素抵抗，最終導(dǎo)致糖代謝、脂代謝異常。有研究報(bào)道，服用10周利培酮的患者體質(zhì)量至少增加4 kg左右，常伴有高三酰甘油和糖尿病[5-6]。有報(bào)道稱，脂肪組織是非典型抗精神病藥物引發(fā)此類不良反應(yīng)的一個(gè)靶點(diǎn)[7]。本實(shí)驗(yàn)研究非典型抗精神病藥物利培酮對3T3-L1前脂肪細(xì)胞分化的影響，結(jié)果表明，0.1 μmol/L組、1 μmol/L組、10 μmol/L組利培酮均抑制了3T3-L1前脂肪細(xì)胞的分化，且組與組之間的抑制作用有明顯差異。

肥胖是應(yīng)用抗精神病藥物后常見的不良反應(yīng)，而肥胖可使機(jī)體體內(nèi)產(chǎn)生一系列復(fù)雜的變化，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)游離脂肪酸增多，肥大的脂肪細(xì)胞會分泌低水平的腫瘤壞死因子(TNF)-α以刺激前脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌人單核細(xì)胞趨化蛋白-1，從而使巨噬細(xì)胞聚集到脂肪組織周圍，引發(fā)較低水平的慢性炎性反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素抵抗[8-9]。另外，游離脂肪酸也可以通過激活絲氨酸激酶來阻斷胰島素的信號傳導(dǎo)，引起胰島素抵抗；TNF-α可通過促使胰島素受體底物發(fā)生絲氨酸磷酸化和絡(luò)氨酸去磷酸化來阻斷胰島素受體的信號傳導(dǎo)，從而導(dǎo)致胰島素抵抗的發(fā)生[10]。因此，非典型抗精神病藥物引起的胰島素抵抗日益被起研究者的重視，隨著分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究及臨床研究的發(fā)展，將進(jìn)一步闡明相關(guān)的機(jī)制，有利于減少對使用此類藥物患者出現(xiàn)糖脂代謝疾病的可能。

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Risperidone inhibits 3T3-L1 pre-adipocytes differentiation

ZHANG Gaoli1,ZHANG Yi2,YU Haichuan3,ZHANG Xinya3

(1.ZhoukouMunicipalCentralBloodStation,Zhoukou,Henan466000,China;2.GeneralHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu,Sichuan610083,China;3.SchoolofLaboratoryMedicine,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan453003,China)

ObjectiveTo investigate the influence of risperidone on differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.Methods3T3-L1 pre-adipocytes were induced to differentiate into mature adipocytes by adopting the classic hormone cocktail method and observed by the oil red O staining.Meanwhile,the inducing medium was added with risperidone for studying its influence on 3T3-L1 pre-adipocytes differentiation.Results3T3-L1 pre-adipocytes were successfully differentiated into the mature adipocytes,0.1,1,10 μmol/L risperidone all could inhibit the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.ConclusionRisperidone can inhibit the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes.

risperidone;3T3-L1 cell;differentiation

2015-12-09修回日期：2016-05-04)

張高麗，女，主管檢驗(yàn)技師，研究方向是生物化學(xué)與分子生物學(xué)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.15.021

A

1673-4130(2016)15-2108-02

·論著·