呂 鑫，隋 昕，李萬華，聶志勇，王永安（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

大鼠動態(tài)吸入氯吡硫磷染毒模型的建立及致傷效應(yīng)評價

呂 鑫，隋 昕，李萬華，聶志勇，王永安
（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

目的 建立大鼠全身暴露動態(tài)吸入有機磷農(nóng)藥氯吡硫磷（CPF）的染毒模型，探討SD大鼠急性吸入CPF致傷效應(yīng)。方法 通過優(yōu)化氣溶膠發(fā)生參數(shù)，建立大鼠急性吸入CPF的動態(tài)暴露環(huán)境；利用吸附采樣-氣相檢測技術(shù)監(jiān)測暴露艙內(nèi)CPF的濃度，利用粒徑監(jiān)測儀實時監(jiān)測暴露艙內(nèi)CPF的粒徑，同時考察氣溶膠的濃度和粒徑隨時間的變化；采用Bliss法，將SPF級雄性SD大鼠置于染毒環(huán)境中進行染毒，在不同濃時積（Ct）下觀察染毒過程中大鼠的癥狀，記錄染毒后各濃度組大鼠10 d內(nèi)的死亡情況；同時根據(jù)半數(shù)致死Ct （LCt50），檢測不同暴露濃度染毒后不同時間點血漿膽堿酯酶（ChE）活性變化。結(jié)果 暴露艙內(nèi)CPF氣溶膠濃度在9個時間段的平均值為160.6 mg·m-3，變異系數(shù)（RSD）為6.9%；氣溶膠粒徑幾何平均值為1.1 μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8，符合國際經(jīng)濟合作與發(fā)展組織急性吸入染毒技術(shù)要求。在此染毒條件下，SD大鼠全身暴露動態(tài)吸入染毒的LCt50為1654.2 mg·m-3·h，隨著染毒濃度的增加，血漿ChE活性抑制愈加明顯（P＜0.05）。結(jié)論 本研究成功建立了大鼠全身暴露動態(tài)吸入CPF染毒模型，為有機磷類工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品以及神經(jīng)性毒劑吸入致傷和防治研究提供實驗平臺和技術(shù)支撐。

氯吡硫磷；氣溶膠；半數(shù)致死濃時積

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.009

氯吡硫磷（chlorpyrifos，CPF），也叫毒死蜱，是一種廣譜高效、低抗藥性的有機磷殺蟲劑（organo?phosphate pesticides，OP），是全球使用量最多的農(nóng)藥之一，被廣泛應(yīng)用于防制水稻、花生、大豆和小麥等多種作物上的害蟲和螨類，同時也用于庭院或居家滅蟲。但是，給人們提供便利的同時，它也帶來了次生和潛在的威脅。首先，CPF過量使用，尤其在發(fā)展中國家，農(nóng)民普遍超高濃度進行噴灑作業(yè)，其降落在植物表面和地面的農(nóng)藥會產(chǎn)生二次揮發(fā)等次生危害［1-2］。其次，CPF廣泛應(yīng)用于居家環(huán)境中［3］，使人群處于長期持續(xù)暴露狀態(tài)，降低人群免疫力，引起哮喘［4］和遲發(fā)性神經(jīng)疾?。?-6］等，這些問題正逐漸引起醫(yī)學(xué)界和普通民眾的關(guān)注。另外，農(nóng)藥在儲存和運輸過程中一旦發(fā)生意外泄露，或遭到恐怖襲擊等［7-8］情況，會使周圍人群短時間內(nèi)處于高濃度有機磷農(nóng)藥的急性暴露環(huán)境中，使生命健康受到威脅。

建立現(xiàn)場模擬的吸入染毒模型，進行生物致傷效應(yīng)評價及防治措施研究，是有效應(yīng)對有機磷農(nóng)藥急性暴露等突發(fā)化學(xué)事件的一種有效手段。但由于吸入染毒對實驗環(huán)境、裝置及釋放技術(shù)均有較高要求［9-10］，且在染毒濃度上要做到均一、穩(wěn)定、可控，染毒粒徑要符合一定規(guī)范文件，如經(jīng)濟合作和發(fā)展組織（Organization for Economic Cooperation and Development，OECD）的要求，所以優(yōu)效的暴露吸入染毒一直是國際性難題。本研究在前期工作［11］的基礎(chǔ)上，通過多次優(yōu)化CPF急性吸入染毒的關(guān)鍵性技術(shù)，建立了大鼠全身暴露動態(tài)吸入CPF染毒模型，明確了暴露艙內(nèi)濃度隨時間的變化趨勢及粒子粒徑等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，最終確定急性吸入中毒半數(shù)致死濃時積（median lethal concentration time，LCt50）；并通過檢測大鼠膽堿酯酶（cholinesterase，ChE）活性進一步對其致傷效應(yīng)進行評價。

1　材料與方法

1.1動物、試劑和儀器

SPF級雄性SD大鼠130只，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。CPF水乳劑（40%，山東省青島東生藥業(yè)有限公司），CPF標(biāo)準(zhǔn)品（96%，北京伊諾凱科技有限公司），甲醇、甲苯和丙酮（分析純，國藥集團北京化學(xué)試劑有限公司），蒸餾水由本實驗室提供。TSE全身暴露裝置（process control inhalation 700400 series），700800-PA-100粒徑監(jiān)測儀（均德國TSE公司），GC-FID，7890A氣相色譜儀-氫火焰燃燒檢測器（美國安捷倫科技有限公司），氣體采樣器（SKC-800，德國），HRH-TIP-286液體定量推進器（惠榮和公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（予華儀器有限責(zé)任公司），砂芯漏斗（100 mL-G1，河南三順教學(xué)儀器有限公司）。

1.2CPF標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及工作曲線的繪制

取96%CPF標(biāo)準(zhǔn)品25 mg，溶于25 mL甲醇溶液中，配成1 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別逐級稀釋為x=10，15，20，30，40和50 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用氣相色譜進行檢測。儀器條件：進樣口溫度280℃，N2流速2.5 mL·min-1，隔熱吹掃3 mL·min-1，不分流進樣；檢測器FID溫度為290℃，H2流速30 mL·min-1，空氣流速400 mL·min-1，尾氣吹掃25 mL·min-1，程序升溫100℃保持1 min，20℃·min-1至280℃，保持1 min；每次進樣1 μL，計算色譜峰面積y，繪制其與濃度關(guān)系的工作曲線。

1.3全身動態(tài)染毒吸入模型的建立

1.3.1CPF氣溶膠態(tài)發(fā)生

將40%CPF水乳劑用砂芯漏斗抽濾去除其中粒徑較大的雜質(zhì)，用蒸餾水將其稀釋至30%，用雙筒液體定量推進器吸取30%CPF水乳，設(shè)置推進速率3 mL·min-1，氣溶膠化速率為20 L·min-1，稀釋氣體速率30 L·min-1，液體氣溶膠化后進入暴露艙染毒，暴露艙壓力為-0.1 Pa。

1.3.2氣溶膠粒徑與濃度的檢測

基于氦氖激光技術(shù)，應(yīng)用粒徑檢測儀，設(shè)置采集速率為100 mL·min-1，監(jiān)測CPF氣溶膠粒子空氣動力學(xué)參數(shù)；同時，用9 mL混合溶劑（甲醇∶甲苯∶丙酮=2∶2∶1）作為吸附劑，利用吸附采樣技術(shù)，采集暴露艙內(nèi)氣溶膠，采集時間（t）為10 min，采集速率（r）為120 mL·min-1，采集液回收定容（V1）10 mL后用GC-FID進行檢測，將測得數(shù)據(jù)代入工作曲線得到CPF溶液濃度c1（mg·L-1）；根據(jù)下面公式得到暴露艙內(nèi)CPF氣溶膠濃度c2（mg·m-3）。公式為c2= c1V1/rt。

1.3.3半數(shù)致死量的測定

通過預(yù)實驗，確定30%CPF吸入染毒最大安全時間（Dn）為5 h，全部大鼠死亡的最短時間（Dm）為20 h，在Dn和Dm間取5個濃度組，根據(jù)Bliss法，染毒濃度間公比為，采用固定染毒濃度，不同染毒時間即5，7，10，14和20 h，將50只SD雄性大鼠隨機分為5組，每組10只，單籠放入艙中進行全身暴露動態(tài)吸入染毒。染毒結(jié)束后取出，觀察并記錄10 d內(nèi)各組大鼠的死亡情況，根據(jù)各組死亡率，用Bliss法計算SD雄性大鼠CPF氣溶膠吸入中毒的LCt50等致傷效應(yīng)參數(shù)。

1.4ChE活性測定

將72只SD雄性大鼠隨機分為3組，每組24只，分別于0.2，0.4和0.8 LCt50濃度下進行全身暴露動態(tài)吸入染毒；另取8只SD雄性大鼠作為正常對照組，正常暴露于相同溫度和濕度的空氣中。染毒結(jié)束后取出，分別在染毒后8 h，1，2及7 d剪尾采全血，正常對照組大鼠同樣操作。血樣肝素抗凝，825×g離心10 min，取上層血漿于-80℃冷凍保存。由國家北京藥物安全評價研究中心檢測ChE活性。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果數(shù)據(jù)以x±s表示，使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1全身動態(tài)染毒吸入模型的評價

2.1.1氣溶膠粒徑大小

粒徑監(jiān)測儀實時監(jiān)測TSE全身暴露裝置中CPF粒徑大小和氣溶膠濃度。圖1結(jié)果顯示，在7.7 s內(nèi)，測定氣溶膠總體積為12.8 mL，總粒子數(shù)為3.4×105，CPF氣溶膠粒徑平均值為1.3 μm，眾數(shù)值為1.3 μm，幾何平均值為1.1 μm，幾何標(biāo)準(zhǔn)差為1.8，最高峰粒子數(shù)為15 850，無第2和第3峰值，符合正態(tài)分布規(guī)律。

Fig.1 Particle size of chlorpyrifos（CPF）aerosol in TSE whole-body exposure chamber.

2.1.2氣溶膠濃度穩(wěn)定性

根據(jù)2.1.1氣相色譜結(jié)果，做出工作曲線y= 7.019x-11.48，R2=0.999。將樣品峰面積代入工作曲線得出CPF溶液濃度c1（mg·L-1），根據(jù)公式計算出CPF氣溶膠平均濃度c2=（160.6±11.1）mg·m-3，相對標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation value，RSD）為6.9%。氣溶膠態(tài)CPF不同時間內(nèi)濃度及RSD如表1。

Tab.1　Concentration of CPF aerosol at different points of exposure time

2.2大鼠急性吸入CPF中毒情況

2.2.1中毒癥狀

實驗過程中，染毒開始15 min后大鼠表現(xiàn)出流涎癥狀，隨后出現(xiàn)流淚、精神萎靡、肌顫、行動困難等有機磷農(nóng)藥急性中毒體征。隨著染毒時間的延長，上述癥狀愈明顯，同時還出現(xiàn)眼鼻出血、呼吸困難、抽搐及死亡等現(xiàn)象。不同濃度染毒結(jié)束后，大鼠行動困難，無法正常進食飲水，其中5 h染毒組在24 h后飲食可恢復(fù)正常，染毒時間越長恢復(fù)愈加緩慢，各組存活大鼠在3 d后基本恢復(fù)正?；顒印?/p>

2.2.2半數(shù)致死濃時積（LCt50）

不同濃度組不同時間大鼠死亡情況如表2所示。根據(jù)表2結(jié)果，利用Bliss法計算得出大鼠急性吸入CPF致傷效應(yīng)參數(shù)。其中，LCt50為1654.3 mg·m-3·h，LCt50的95%可信限=1376.2～1995 mg·m-3·h-1，LCt5為907.5 mg·m-3·h，LCt95為3015.6 mg·m-3·h。

2.3大鼠急性吸入CPF后全血ChE活性變化

通過對不同LCt50下CPF染毒后各采樣點測得的ChE活性分析來看，0.2，0.4和0.8 LCt503組染毒后8 h，1和2 d的ChE活性與正常對照組相比明顯下降（P＜0.05）；第7天ChE活性恢復(fù)接近正常值。其中前2組ChE活性呈先降后升趨勢，0.8 LCt50組ChE活性由最低值呈逐漸上升趨勢。ChE活性的抑制和大鼠染毒后癥狀恢復(fù)情況相一致，隨著染毒濃度的增加大鼠中毒癥狀逐漸加重，其中0.8 LCt50組大鼠恢復(fù)最慢（表3）。

0.2和0.4 LCt50組染毒后各采樣點中ChE抑制最低值出現(xiàn)在染毒后第1天，抑制率分別為69.2% 和78.0%；0.8LCt50組ChE抑制最低點為染毒后8 h，抑制率為85.2%。0.8 LCt50組染毒ChE活性最低為（13.5±1.85）U·L-1，明顯低于另2組ChE活性最低值分別為28±2.11和（20±2.45）U·L-1（P＜0.05）。

Tab.2 Deaths of rats at different concentrations after CPF acute inhalation exposure

Tab.3 Plasma cholinesterase（ChE）activity of rats at different times and concentrations after CPF acute inhala?tion exposure

3　討論

建立一種穩(wěn)定可控的現(xiàn)場模擬吸入染毒模型，評價有機磷類農(nóng)藥的致傷效應(yīng)，能更好地對其進行防治研究。本研究通過選擇和調(diào)節(jié)CPF水乳劑推進速度、空氣流速、氣溶膠化速率等條件，實現(xiàn)了CPF氣溶膠粒徑平均值（1.3 μm）、眾數(shù)值（1.3 μm）、幾何平均值（1.1 μm）相近，呈正態(tài)分布規(guī)律，證明實驗中粒子大小均勻，符合OECD 403/433急性吸入毒性實驗指導(dǎo)原則要求，與前期實驗結(jié)果一致［11］，暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度隨時間的變化保持穩(wěn)定（160.6± 11.1）mg·m-3，RSD＜7%，證明暴露艙內(nèi)氣溶膠濃度達到了穩(wěn)定可控。

本研究中，大鼠急性暴露動態(tài)吸入致傷效應(yīng)參數(shù)結(jié)果顯示，LCt5和LCt50等數(shù)值較大，一方面證明CPF是一種中低毒有機磷農(nóng)藥，使用安全性高；另一方面也可能與CPF進入大鼠體內(nèi)后吸收代謝較快有關(guān)。美國環(huán)境保護局規(guī)定的CPF最高暴露濃度為0.6 mg·m-3，但在實際使用過程中，CPF氣溶膠往往遠大于此濃度。另外，泄露、恐襲等突發(fā)事件，使得有機磷類農(nóng)藥瞬時產(chǎn)生超高濃度，在短時間內(nèi)威脅暴露范圍內(nèi)人群的健康安全，嚴(yán)重時甚至導(dǎo)致死亡，CPF急性吸入染毒模型的建立及致傷機制的研究可有效應(yīng)對此類情況，并對模擬實戰(zhàn)有一定技術(shù)支撐意義。

CPF是一種廣譜有機磷殺蟲劑，動物中毒后抑制ChE，使突觸乙酰膽堿蓄積，主要引起神經(jīng)毒性，表現(xiàn)膽堿能神經(jīng)中毒的癥狀，如大量流涎、流淚、排尿、排便、共濟失調(diào)和震顫等。已知研究表明，動物CPF中毒后的神經(jīng)行為及ChE抑制，與急性暴露的CPF濃度有關(guān)，濃度越高，癥狀越明顯［12］。一般情況下，當(dāng)腦ChE抑制＞60%時開始出現(xiàn)膽堿能中毒癥狀［13］。從濃度-效應(yīng)關(guān)系分析，ChE抑制被認(rèn)為是反映CPF毒性的最敏感的指標(biāo)［14］。

染毒后動物血漿ChE活性呈緩慢恢復(fù)，其最佳理論峰值與機體代謝物水平有關(guān)，不同性別、日齡均有差異，因此采樣時間的選擇及對照組數(shù)值的測量存在一定的不確定性。本研究選取的時間點反映的ChE變化情況，有助于了解暴露于不同濃時積與動物狀態(tài)及ChE值的變化趨勢，一定程度上呈正相關(guān)。

本研究對0.2，0.4和0.8 LCt503個濃度下CPF氣溶膠吸入染毒后8 h，1，2和7 d等4個時間點的大鼠血漿ChE活性變化進行了測定，以確定染毒時間對血漿中ChE的抑制規(guī)律，為用藥治療尋找合適時間點。0.2 LCt50和0.4 LCt50組ChE的抑制峰值出現(xiàn)在染毒結(jié)束后1 d；0.8 LCt50組的采樣時間點是在染毒結(jié)束后8 h。但從ChE變化規(guī)律分析，理論上8 h采樣點前某一時間點應(yīng)有一相對高值，以后將對此作進一步研究證明。CPF 0.8 LCt50暴露水平誘導(dǎo)約85.2%的ChE抑制，ChE活性和CPF全身暴露水平之間存在生理藥代動力學(xué)/藥效學(xué)的模型關(guān)系［15］。暴露濃度影響整個機體組織的ChE抑制情況，不同部位（腦、紅細胞和血漿等）ChE抑制與各種因素有關(guān)，如毒物吸收、分布、代謝、排泄及個體差異等。

本研究成功建立了CPF氣溶膠吸入染毒模型，為CPF吸入染毒致傷效應(yīng)及防治研究提供了染毒濃度依據(jù)，為高毒化學(xué)品及化學(xué)戰(zhàn)劑動態(tài)暴露吸入染毒模型的建立提供了參考，并為高毒化學(xué)品吸入毒理學(xué)研究提供了技術(shù)支撐。

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本文編輯：齊春會）

Model establishment and injury assessment of chlorpyrifos dynamic-inhalation of rats

LYU Xin，SUI Xin，LI Wan-hua，NIE Zhi-yong，WANG Yong-an
（State Key Laboratory of Toxicology and Medical Countermeasures，Institute of Toxicology and Pharmacology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China）

OBJECTlVE To establish a model for chlorpyrifos（CPF）whole-body dynamic inhalation exposure in SD rats and investigate the injury effects after acute exposure by CPF.METHODS By optimizing the aerosol parameters，the animal acute dynamic inhalation exposure of CPF was established. Absorption sampling-gas phase detecting technology was used to monitor the concentration of CPF in the whole-body dynamic-inhalation exposure cabin by exploring the relationship between the concentration，particle size of CPF aerosol and the CPF inhalation time in the exposure cabin via a particle size detector. Using Bliss method，specific pathogen free SD male rats were allocated to the environment of CPFexposure at different lethal concentrations and time points.The symptoms and deaths of these SD male rats in different groups were recorded within the following 10 d.Based on the median lethal concentra?tion time（LCt50），the values of plasma cholinesterase（ChE）were checked at different time points after being exposed at different doses.RESULTS The mean concentrations of CPF aerosol at nine time points was 160.6 mg·m-3，the relative standard deviation value was 6.9%；the geometrical mean of aerosol particle size was 1.1 μm，and the geometric standard deviation was 1.8.The results met the technical requirements of Organization for Economic Cooperation and Development regarding acute inhalation exposure.Under these equipment conditions，the LCt50of CPF acute inhalation of SD male rats was 1654.2 mg·m-3·h，suggesting that plasma ChE inhibitory rate was higher with the increase in the exposing dose，and that there was a significant difference as compared with the controls（P＜0.05）.CONCLU?SlON The model for whole-body dynamic-inhalation exposure of CPF is applicable to rats，which can serve as an experimental platform and technical support to inhalation vulnerability and the research on prevention and cure of organophosphate industrial products and nerve agents.

chlorpyrifos；aerosol；median lethal concentration time

NIE Zhi-yong，E-mail：niezhiyong2008@163.com；WANG Yong-an，Tel：（010）66874607，E-mail：yonganw@sina.com

R966

A

1000-3002-（2016）04-0356-06

呂 鑫，女，碩士研究生，主要從事軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)研究，E-mail：pinkmoonlx@163.com

聶志勇，E-mail：niezhiyong2008@163.com；王永安，Tel：（010）66874607，E-mail：yonganw@sina.com

2015-08-17接受日期：2016-04-05）（