陳春梅　馮姣　陳志文　肖星　蔣敏敏　史茗嵐　賀莉雅　蔡文瑩　席麗艷　李希清

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院,廣州 510120)

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原生質(zhì)體介導(dǎo)馬爾尼菲青霉基因轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化

陳春梅馮姣陳志文肖星蔣敏敏史茗嵐賀莉雅蔡文瑩席麗艷李希清

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院,廣州 510120)

目的優(yōu)化原生質(zhì)體介導(dǎo)的馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化體系，為其基因功能研究提供良好的平臺(tái)。方法通過(guò)原生質(zhì)體介導(dǎo)將構(gòu)巢曲霉 (Aspergillusnidulans)pyrG基因插入馬爾尼菲青霉尿嘧啶缺陷株ligD (pyrG-，ligD-)中，在不含尿嘧啶的培養(yǎng)基中篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，運(yùn)用PCR驗(yàn)證重組子，通過(guò)改變影響轉(zhuǎn)化效率的酶解時(shí)間、培養(yǎng)基濃度、質(zhì)粒濃度、不同配方的原生質(zhì)體洗滌液STC和不同配方的原生質(zhì)體助融劑PTC 5個(gè)條件對(duì)體系進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果PCR驗(yàn)證A.nidulanspyrG基因成功的插入ligD中，轉(zhuǎn)化子可穩(wěn)定傳代。最適合ligD原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的條件為：酶解時(shí)間6 h，PTC (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒，0.6 mol/L蔗糖SD/SDU篩選/再生培養(yǎng)基，每1 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子可達(dá)68個(gè)左右。結(jié)論成功優(yōu)化了原生質(zhì)體介導(dǎo)馬爾尼菲青霉轉(zhuǎn)化體系的條件，優(yōu)化后該方法轉(zhuǎn)化效率高，為基因功能研究提供良好平臺(tái)。

馬爾尼菲青霉；原生質(zhì)體；轉(zhuǎn)化

[Chin J Mycol，2016，11(3):140-144]

馬爾尼菲青霉 (Penicilliummarneffei，PM)是青霉菌中唯一的溫度依賴性雙相菌，可引起人類播散性和進(jìn)行性感染，主要在東南亞流行，我國(guó)以廣東、廣西多發(fā)，PM主要侵犯免疫受損者，尤其是艾滋病患者，近年來(lái)隨著HIV感染的增多，馬爾尼菲青霉病 (penicilliosis marneffei，PSM)發(fā)病率逐年上升[1,2]。對(duì)馬爾尼菲青霉菌致病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)，是了解其溫度雙向性、疾病發(fā)病機(jī)制、與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用的基礎(chǔ)，基因轉(zhuǎn)化技術(shù)是研究基因功能的方法之一。目前用于絲狀真菌的轉(zhuǎn)化方法包括[3]原生質(zhì)體法、醋酸鋰法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法[4-5]、電穿孔法[6]等。其中原生質(zhì)體法最常見，本研究以絲狀真菌PM菌株ligD基因敲除株作為研究對(duì)象，利用攜帶有A.nidulanspyrG的質(zhì)粒pALX223對(duì)其原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，摸索原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的最佳條件和方法，為進(jìn)一步提高PM在表達(dá)外源基因的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)菌株P(guān)M尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷株ligD (pyrG-，ligD-)由廣西醫(yī)科大學(xué)曹存巍教授惠贈(zèng)。

質(zhì)粒pALX223為篩選標(biāo)記A.nidulanspyrG來(lái)源，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)真菌和真菌病研究中心李若瑜教授惠贈(zèng)。

培養(yǎng)基用含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB (Luria-Bertani，LB)培養(yǎng)基培養(yǎng)攜帶pyrG基因的重組大腸桿菌 (TOP10 TIANGEN CB104)；真菌培養(yǎng)基：PDA+U，SDU培養(yǎng)基，SD培養(yǎng)基，0.4/0.6/0.8/1.2 (mol/L)蔗糖SD培養(yǎng)基，0.4/0.6/0.8/1.2 (mol/L)蔗糖SDU培養(yǎng)基。具體配置方法參照文獻(xiàn)[7-8]。

主要試劑酶解液 (sigma的溶壁酶)，原生質(zhì)體洗滌液STC (STC1：1.2 mol/L D-Sorbitol,10 mmol/L Tris-HCl pH7.5,10 mmol/L CaCl2;STC2：1 mol/L D-Sorbitol,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2)；原生質(zhì)體助融劑PTC (PTC1:60%PEG-4000，10 mmol/L Tris-HCl pH7.5,10 mmol/L CaCl2;PTC2:60%PEG-4000,50 mmol/L Tris-HCl pH8.0,50 mmol/L CaCl2;PTC3:60%PEG-4000,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2;PTC4:40%PEG-3350,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2)。

1.2方法

質(zhì)粒的提取使用LB培養(yǎng)基 (含100 μg /mL氨芐青霉素)37℃ 200 r/min復(fù)蘇和擴(kuò)大培養(yǎng)攜帶含有pyrG基因的重組大腸桿菌。擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液按照質(zhì)粒中提試劑盒 (Promega A2492)說(shuō)明書提取質(zhì)粒并測(cè)OD值 (300～500 ng/μL)。

PM孢子懸液的制備將在PDA+U斜面培養(yǎng)的ligD用吐溫-生理鹽水沖洗孢子，轉(zhuǎn)移至400 mL SDU液體培養(yǎng)基中，37℃搖床150 r/min振蕩培養(yǎng)40 h。

原生質(zhì)體制備與純化用含1層Miracloth濾紙的漏斗過(guò)濾收集孢子懸液，用預(yù)冷的0.6 mol/L MgSO4重懸洗滌3次，菌體稱濕重，轉(zhuǎn)移至含有濾過(guò)除菌的酶解液 (按照1 g菌絲10 mL酶解液)的滅菌錐形瓶中，28℃，100 r/min搖床分別振蕩酶解4 h、6 h、8 h、10 h，顯微鏡下實(shí)時(shí)觀察原生質(zhì)體形成情況。用含2層Miracloth+2層擦鏡紙的漏斗過(guò)濾除去殘余的菌體碎片，用STC離心洗滌2次 (4℃,5 000 r/min，5 min)，沉淀最后用洗滌液重懸并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù) (所用試劑及用品均已高壓或?yàn)V過(guò)滅菌)。

轉(zhuǎn)化及再生每100 μL (106～107/mL)原生質(zhì)體懸液中分別加入1 μg，2.5 μg、5 μg、7.5 μg質(zhì)粒，25 μL PTC輕輕混勻后冰上放置30 min，加入1 mL PTC顛倒混勻后室溫放置30 min，STC重懸離心去上清。加入1.2 mL液體0.4/0.6/0.8/1.2 (mol/L)蔗糖SDU，取100 μL涂布0.4/0.6/0.8/1.2 (mol/L)蔗糖SDU平板，對(duì)照組用ddH2O重懸后涂布。剩余1 mL室溫?fù)u菌2 h后取100 μL涂布于0.4/0.6/0.8/1.2 (mol/L)蔗糖SD高滲篩選培養(yǎng)基，分別置于室溫與37℃培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌落后挑菌至低滲SD培養(yǎng)基，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，多次傳代，以純化轉(zhuǎn)化子。

轉(zhuǎn)化子PCR驗(yàn)證從SD培養(yǎng)基中挑取少量菌絲，提取DNA，用pyrG上下游引物行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸2 min，4℃保存。1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，在1 369 bp處出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，證實(shí)pyrG基因成功的整合入ligD (見圖1)。

2　結(jié)　　果

2.1不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響

相同條件下在SDU液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h的菌體，分別酶解4 h、6 h、8 h、10 h，菌體酶解后，用顯微鏡觀察原生質(zhì)體并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，在同一條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其他條件為：STC2 (1 mol/L D-Sorbitol，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，PTC3 (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒，0.6 mol/L蔗糖SD/SDU篩選/再生培養(yǎng)基，最后的轉(zhuǎn)化子個(gè)數(shù)如圖2。結(jié)果表明酶解時(shí)間是影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的顯著因素，6 h與4 h、8 h、10 h相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，6 h時(shí)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率最高，為 (68.67±9.50)個(gè)/μg。

2.2不同濃度及pH的原生質(zhì)體洗滌液對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響

2.3不同濃度及pH的助融劑PTC對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響

PEG (聚乙二醇)是DNA與原生質(zhì)體的融合劑，在Ca2+幫助下，PEG形成DNA與原生質(zhì)體的分子橋，引導(dǎo)DNA進(jìn)入原生質(zhì)體。如圖3所示PTC3 (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)下可獲得最多的轉(zhuǎn)化子，為 (68.66±4.93)個(gè)/μg，其他條件為：酶解時(shí)間6 h，STC2 (1 mol/L D-Sorbitol，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒，0.6 mol/L蔗糖SD/SDU篩選/再生培養(yǎng)基。

2.4不同濃度蔗糖篩選/再生培養(yǎng)基對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響

篩選及再生培養(yǎng)基中蔗糖既為真菌提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)也是滲透壓穩(wěn)定劑，濃度太低原生質(zhì)體易破裂，濃度太高導(dǎo)致原生質(zhì)體脫水反而不利于其生長(zhǎng)，結(jié)果表明0.6 mol/L蔗糖SD及SDU濃度最適合原生質(zhì)體的生長(zhǎng)，與其余3個(gè)濃度相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)，如圖4所示，為 (68.33±7.23)個(gè)/μg，其他條件為：酶解時(shí)間6 h，STC2 (1 mol/L D-Sorbitol，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，PTC3 (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒。

2.5不同濃度質(zhì)粒對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響

在100 μL純化的原生質(zhì)體 (106～107/mL)中分別加入1 μg、2.5 μg、5 μg、7.5 μg含有pyrG的重組質(zhì)粒，其他條件為：酶解時(shí)間6 h，STC2 (1 mol/L D-Sorbitol，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，PTC3 (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，0.6 mol/L蔗糖SD，由圖5知，轉(zhuǎn)化子數(shù)隨著質(zhì)粒濃度增加而增加，當(dāng)加入2.5 μg質(zhì)粒時(shí)，獲得的轉(zhuǎn)化子數(shù)達(dá)到高峰，增加質(zhì)粒濃度轉(zhuǎn)化子數(shù)基本不再增長(zhǎng)，2.5 μg與5 μg轉(zhuǎn)化子數(shù)之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)質(zhì)粒達(dá)到7.5 μg時(shí)轉(zhuǎn)化子數(shù)反而有減少的趨勢(shì)，加入2.5 μg的質(zhì)?？色@得較高的轉(zhuǎn)化效率。

在上述優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件下進(jìn)行l(wèi)igD的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：酶解時(shí)間6 h，PTC (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，0.6 mol/L蔗糖SD/SDU篩選/再生培養(yǎng)基，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒，每1 μg質(zhì)粒平均可獲得68個(gè)轉(zhuǎn)化子。

3　討　　論

通過(guò)對(duì)影響原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的幾個(gè)主要因素進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，最適合ligD原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的條件為：酶解時(shí)間6 h，PTC (60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2)，每100 μL原生質(zhì)體 (106～107/mL)加入2.5 μg質(zhì)粒，0.6 mol/L蔗糖SD/SDU篩選/再生培養(yǎng)基。用1.2 mol/L D-Sorbitol,10 mmol/L Tris-HCl pH7.5,10 mmol/L CaCl2與1 mol/L D-Sorbitol,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2作為原生質(zhì)體洗滌劑，兩者之間轉(zhuǎn)化效率沒有明顯差異。在上述條件下進(jìn)行l(wèi)igD的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，平均可獲得68個(gè)轉(zhuǎn)化子 (如圖6為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株)。

圖1陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子PCR電泳圖圖2不同酶解時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響圖3PTC對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響 (*.P<0.05) 圖4培養(yǎng)基濃度對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響圖5質(zhì)粒濃度對(duì)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率的影響圖6陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株 (取100 μL涂板)

Fig.1Electrophoretogram of the positive transformantsFig.2Effect of enzymatic time on transformation frequency of ligDFig.3 Effect of PTC on transformation frequency of ligD (*.P<0.05)Fig.4Effect of sucrose concentration in medium on transformation frequency of ligDFig.5Effect of plasmid amount on transformation frequency of ligDFig.6Posotive transformants (take 100 μL coating plate)

用酶解液處理菌體幾分鐘就開始釋放原生質(zhì)體，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，釋放速度逐漸加快，到達(dá)高峰期之后，由于破壁酶的活性降低，有一段相對(duì)穩(wěn)定期，酶解時(shí)間過(guò)短，破壁不完全，不利于轉(zhuǎn)化，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，新的原生質(zhì)體不再釋放，已釋放的原生質(zhì)體又不斷破裂，原生質(zhì)體量反而減少，從而影響轉(zhuǎn)化效率[9]。達(dá)到高峰期時(shí)間隨不同的菌種以及不同的酶解條件而不同。滲透壓對(duì)所有生物的生長(zhǎng)都有非常重要的影響，真菌細(xì)胞經(jīng)過(guò)溶壁酶處理為原生質(zhì)體后因其失去了細(xì)胞壁的壓力勢(shì)，對(duì)環(huán)境的滲透壓變化更加敏感，只有給原生質(zhì)體提供一個(gè)與其基本相同的滲透壓環(huán)境，才能維持原生質(zhì)體的活力，提高原生質(zhì)體的再生率和轉(zhuǎn)化率，這是至關(guān)重要的，山梨醇和蔗糖都是常用的滲透壓穩(wěn)定劑[10]。原生質(zhì)體的分離純化和再生是兩個(gè)完全不同的體系及生理代謝過(guò)程，因而所要求的滲透壓穩(wěn)定劑是有差異的，ligD原生質(zhì)體再生以0.6 mol/L蔗糖效果最好。具有特殊結(jié)構(gòu)的水溶性高分子能誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，其中聚乙二醇 (PEG)使用最廣泛，促進(jìn)原生質(zhì)體融合能力最強(qiáng)，PEG通過(guò)氫鍵與原生質(zhì)體膜上的結(jié)合水結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致原生質(zhì)體失水，引起原生質(zhì)體的凝聚作用，發(fā)生融合。為發(fā)揮PEG最高的促融合效力，須采用較高濃度，相對(duì)分子質(zhì)量3 350～6 000，pH7～9，堿性的pH能夠增強(qiáng)PEG促融合的效果，CaCl2為10～100 mmol/L，鈣離子的作用是強(qiáng)烈促進(jìn)脂分子的擾動(dòng)和重新組合，促進(jìn)融合，但在高濃度的PEG下，原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)也會(huì)受到破壞、失水收縮，高濃度還有一定的毒性，融合率及轉(zhuǎn)化率都會(huì)下降。結(jié)果表明60%PEG-4000，100 mmol/L Tris-HCl pH8.0，100 mmol/L CaCl2轉(zhuǎn)化效率最高。質(zhì)粒量過(guò)多或過(guò)少均影響轉(zhuǎn)化率，質(zhì)粒量過(guò)少時(shí)，質(zhì)粒DNA太少不足以產(chǎn)生高轉(zhuǎn)化效率，而當(dāng)質(zhì)粒量增大超過(guò)閾值時(shí)，細(xì)胞能吸收的質(zhì)粒DNA達(dá)到飽和，繼續(xù)增加質(zhì)粒量也不會(huì)增加轉(zhuǎn)化效率質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA與原生質(zhì)體的比例為2.5 μg DNA：106～107/mL可獲得最高的轉(zhuǎn)化效率。

因?yàn)槎嘁蛩囟嗨浇换ナ綄?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)復(fù)雜，所需樣本量和誤差大，且耗費(fèi)大量時(shí)間和費(fèi)用，本研究參考袁錫華[7]和Borneman等[8]馬爾尼菲青霉基因轉(zhuǎn)化、黑曲霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[11]相關(guān)文獻(xiàn)，通過(guò)限定部分原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參數(shù)來(lái)摸索和比較各個(gè)因素較優(yōu)化的水平，滿足后續(xù)馬爾尼菲青霉基因功能研究的需要。

本研究通過(guò)摸索比較各因素，優(yōu)化馬爾尼菲青霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的條件，為后續(xù)馬爾尼菲青霉基因功能研究的提供了一個(gè)良好的平臺(tái)。

致謝：感謝澳大利亞Alex Andrianopoulos教授和廣西醫(yī)科大學(xué)曹存巍教授提供的技術(shù)指導(dǎo)。

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[本文編輯]施慧

Optimization of the protoplast-mediated transformation system ofPenicilliummarneffei

CHEN Chun-mei,FENG Jiao,CHEN Zhi-wen,XIAO Xing,JIANG Min-min,SHI Ming-lan,HE Li-ya,CAI Wen-ying,XI Li-yan,LI Xi-qing

(SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China)

ObjectiveThis study aims to optimize the protoplast-mediated transformation system ofPenicilliummarneffei,it would provide a good platform for the gene function research ofP.marneffei.MethodsWe inserted the selectable markerpyrGgene (fromA.nidulans) intoP.marneffeistrain ligD (pyrG-，ligD-) by protoplast method,screened positive transformant by medium without uracil,and used PCR to verify the restructuring.Through changing some important effecting factors including enzymolysis period,concentration of plasmid,protoplast fusion agents PTC and screening culture medium to find out the optimal protocol.ResultsAs a result,The positive transformants growed well in the media without uracil，and PCR analysis showed thatpyrGwas inserted into the transformants,the appropriate conditions for protoplast-mediated transformation ofP.marneffeiwere as follows:enzymatic time is 6 h;PTC:60%PEG-4000,100 mmol/L Tris-HCl pH8.0,100 mmol/L CaCl2;0.6 mol/L sucrose screening culture medium;add 2.5 μg plasmid per 100 μL protoplast (106～107/mL).The transformation efficiency was about 68 transformants/μg plasmid DNA under these conditions.ConclusionsProtoplasts-mediated transformation inP.marneffeiwas successfully optimized,this method could get high transformation efficiency and provide a good platform forP.marneffeigene function research.

Penicilliummarneffei；protoplast；transformation

2015-11-02

國(guó)家自然科學(xué)基金 (81171545)

陳春梅，女 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:jxxgxyc@163.com

李希清,E-mail:lixiqing1965@163.com

R 379.9

A

1673-3827(2016)11-0140-05