楊 平, 武曉莉, 周軼群, 朱晶晶, 郭 妤, 陳 亮, 楊清建, 盧勇舟, 賈傳龍, 劉天一

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實驗研究

miRNA在皮膚瘢痕組織中的表達研究

楊 平, 武曉莉, 周軼群, 朱晶晶, 郭 妤, 陳 亮, 楊清建, 盧勇舟, 賈傳龍, 劉天一

目的 研究正常皮膚組織、非增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織中miRNA的表達，篩選對瘢痕異常增生可能發(fā)揮作用的miRNA。方法 使用miRNA芯片檢測正常皮膚組織(C)、非增生性瘢痕(T1)和瘢痕疙瘩(T2)中miRNA的表達譜，并對各組miRNA進行對比，篩選共同表達但表達有差異的miRNA部分，再選取其中表達差異較為明顯的miRNA，對其進行Real-Time quantitative PCR驗證實驗。結(jié)果 共計測得miRNA 2539條，差異表達結(jié)果為：T1/C，上調(diào)2/下調(diào)17；T2/C，上調(diào)3/下調(diào)94；T2/T1，上調(diào)9/下調(diào)87。選取差異表達顯著的miRNA，從C至T2，miR-100、miR-29a表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，而miR-181a、miR-198表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。結(jié)論 非增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的miRNA表達均有別于正常皮膚組織，而miR-100、miR-29a、miR-181a、miR-198對瘢痕組織內(nèi)成纖維細胞增殖和膠原合成過程中發(fā)揮作用的重要信號通路均有影響。瘢痕增生是多基因復合性表達作用的結(jié)果。

miRNA； 正常皮膚組織； 非增生性瘢痕； 瘢痕疙瘩； 瘢痕增生

MicroRNA(miRNA) 是一類小的、內(nèi)源性的非編碼RNAs，主要是通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式實現(xiàn)對基因表達進行調(diào)控。自2013年1月至2015年12月，復旦大學附屬華東醫(yī)院整形美容科對臨床獲取的正常皮膚組織、非增生性瘢痕和瘢痕疙瘩進行miRNA芯片檢測和驗證，探討在瘢痕形成過程中，miRNA表達情況以及miRNA對瘢痕異常增生的部分作用機制。

1 對象與方法

1.1 試劑和儀器設備

TRIzol Reagent、Amino AllylMessageAmpTMⅡ aRNA、Amplification Kit、Trizol (美國INVITROGEN公司)，Mono Cy5 reactive Dye(美國GE公司)，Whole Genome OneArray Microarray(美國PHALANX公司)，RNA酶抑制劑(美國PROMAGE公司)，反轉(zhuǎn)錄酶、10×RT緩沖液、2×Sybrgreen PCR mix(德國QIAGEN公司)，2.5 mM dNTP 混合液(dATP，dGTP，dCTP和dTTP各2.5 mM)，TBE、6×Loading buffer(上海捷蘭生物技術(shù)有限公司)；微量分光亮度計 #NanoDrop 2000(美國THERMO SCIENTIFIC公司)，核酸擴增儀(PCR，美國ABI公司)，水平電泳設備(mini agarose gel electrophoresis system,美國ADVANCE CO公司)核酸真空濃縮干燥機(speed vacuum,德國EPPENDORF公司)，Hybridization incubator (rotor+orbital shaking,美國COCONO公司)，Oven (orbital shaker,中國臺灣YIH DER公司)，Agilent Microarray Scanner(美國AGILENT公司)。

1.2 取材及分組處理

實驗標本均來自華東醫(yī)院整形美容科患者，男女不限，年齡15～22歲。非增生性瘢痕和瘢痕疙瘩病程均超過1年，未進行任何治療。正常皮膚組織取自皮瓣修整患者，男女不限，年齡26～32歲。手術(shù)切取標本后，去除表皮和皮下脂肪，立即置于液氮內(nèi)送達實驗室。將其分為正常皮膚組(C)，非增生性瘢痕組(T1)，瘢痕疙瘩組(T2)，每組3例。均取得患者知情同意。

2 實驗方法

2.1 芯片檢測實驗

miRNA提取和芯片檢測。

2.1.1 總RNA抽提 取少許樣品組織，用Trizol-氯仿法提取1 μl總RNA測OD260，并定量。

2.1.2 微小核酸分離純化 將總核酸使用Nanosep 100 k (Pall)和Vivaspin 500 3 k (sartorius stedim biotech)離心，保留上層溶液即為分離純化之微小核酸溶液，進行OD測定，置于冰上，等待熒光標定步驟。

2.1.3 ΜLS 熒光標定 將ΜLS試劑按標準操作程序與微小核酸溶液混合，離心。將溶液進行OD測定熒光吸收光譜，計算熒光標定值，避光置于冰上，等待雜交反應。

2.1.4 前雜交處理 ⑴將芯片取出，置入100%乙醇，靜置20 s。⑵取出置入E-box，以純水清洗，上下?lián)u晃3 min后，置入已預熱好之前雜交溶液于42℃烘箱靜置2 h。⑶取出置入已裝入新鮮純水之E-box清洗，上下?lián)u晃3 min后，取出芯片離心甩干，避光備用。

2.1.5 miRNA OneArrayTM雜交反應 ⑴微小RNA芯片完成前雜交反應后，與OneArray Double Chamber黏合，并翻轉(zhuǎn)確認Chamber膠框完全密合。⑵將以標定之熒光小核酸樣品與 2×miRNA OneArray Hyb Buffer混合并加純水將總體積制備為 90 μl。⑶樣品進行PCR加熱 95℃，2 min后，以微量吸量管加入一端樣品注入口，注入后將注入口以圓形黏性貼將Chamber兩端封口。⑷將以注入樣品之芯片置于以預熱之37℃ 雜交烘箱中，2 r/min垂直轉(zhuǎn)速， 16 h。并預熱清洗溶液。⑸16 h后，將芯片取出，并于預熱37℃清洗溶液 (buffer Ⅰ) 拆除Chamber，進行清洗。buffer Ⅰ 37℃, 5 min,80 r/min;buffer Ⅱ 37℃, 5 min, 80 r/min;再進行1次 buffer Ⅱ 5 min,25℃后，以 buffer Ⅲ,室溫清洗5 min，最后離心，將芯片甩干。避光,等待掃描。

2.1.6 影像掃描與數(shù)據(jù)選取 miRNA OneArray?芯片使用的掃描儀為Agilent Microarray Scanner。由適當?shù)臒晒鈴姸扰c分辨率(10 μm) 獲得最佳影像。利用GenePixTM4進行影像數(shù)據(jù)而選取，獲得初級數(shù)據(jù)格式gpr檔案，即將影像轉(zhuǎn)成數(shù)值，進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

2.2 Real Time quantitive PCR 檢測實驗

2.2.1 cDNA合成 總RNA抽提步驟同上。⑴primer合成列表，見表1。⑵操作方法：按標準RT反應程序添加試劑并在PCR儀進行RT反應，反應結(jié)束后，將其放在冰上待用。

2.2.2 實時定量PCR 所有cDNA樣品分別配制Realtime PCR反應體系。按照標準程序進行體系配置，于Realtime PCR儀上進行PCR反應。

2.2.3 結(jié)果與計算 對各樣品的目的miRNA和內(nèi)參(U6)分別進行Realtime PCR反應。數(shù)據(jù)采用2-△△ CT法進行分析。

3 結(jié)果

3.1 芯片檢測結(jié)果

芯片原始圖像：正常皮膚真皮組織、非增生性瘢痕、瘢痕疙瘩，共檢測到miRNA 2539條(圖1)；柱狀圖顯示所有檢出的基因探針于分組比對中，信號差異的分布。柱狀圖的橫坐標以 log2 表示差異倍數(shù)，縱坐標則代表探針數(shù)目(圖2)；火山圖顯示分組比對中差異基因探針的分布。橫坐標以log2表示差異倍數(shù)，縱坐標以負 log (P值)代表差異的顯著性。紅色/綠色虛線分別代表P值及倍數(shù)篩選的閾值。圖中每一個點為一個檢出的基因探針, 差異探針標示為藍色點(圖3)。圖4中每一列為1張芯片，每一列為1個基因探針。紅綠色階標示了探針信號上調(diào)/下調(diào)的變化幅度。線的長度則代表距離指標，同簇樣本或基因的相似性高 (模式相近)。差異基因的篩選條件設定為 log2 |Fold change|≥0.8，且P<0.05，見表2。

表1 引物堿基序列

圖1 芯片圖像 a.正常皮膚真皮組織 b.非增生性瘢痕 c.瘢痕疙瘩 圖2 基因探針分組比對中信號差異的分布 a.T2/T1b.T2/C c.T1/C

Fig 1 Microarray image. a. normal skin dermal tissue. b. Non-hypertrophic scar. c. Keloid. Fig 2 The different signal distribution of gene probe in group comparison. a. T2/T1. b. T2/C. c. T1/C.

3.2RealTime-PCR檢測結(jié)果分析

根據(jù)差異表達水平篩選和文獻報道，選擇miR-100、miR-29a、miR-181a、miR-198進行RT-PCR檢測

表2 miRNA各組表達差異對比

分析。結(jié)果顯示，從C至T2，miR-100、miR-29a表達呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，而miR-181a、miR-198表達呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(圖5)。

圖3 火山圖示分組比對中差異基因探針的分布 a.T2/T1b.T2/C c.T1/C 圖4 聚類分析圖 圖5 各組特異miRNA相對表達量 a.mir-29a相對表達量 b.mir-100相對表達量 c.mir-181a相對表達量 d.mir-198相對表達量

Fig 3 Distribution of differentially expressed genes in the group comparison of the volcano maps. a.T2/T1. b.T2/C. c.T1/C. Fig 4 Image of clustering analysis. Fig 5 Relative expression of specific miRNA in each group. a.miR-29a relative expression. b.miR-100 relative expression. c.miR-181a relative expression. d.miR-198 relative expression.

4 討論

病理性瘢痕是皮膚損傷后發(fā)生的異常瘢痕愈合，表現(xiàn)為增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。通常是真皮損傷后組織異常修復的結(jié)果，組織學上以成纖維細胞的過度增生和細胞外基質(zhì)的過度聚集為特征。病理性瘢痕的發(fā)病機制和防治一直是長期困擾整形外科的難題之一。由于瘢痕增生的發(fā)病機制復雜，影響因素多，至今尚未完全明確，因而缺乏針對性的治療，目前常規(guī)的治療方法包括手術(shù)切除、類固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑的治療以及放射療法等。治療效果往往不夠理想，復發(fā)率極高[1]。

當前對于增生性瘢痕的發(fā)病機制研究取得了一些進展，研究已經(jīng)深入基因和細胞因子水平，部分瘢痕疙瘩易感基因位點已經(jīng)確定，并且證實部分生長因子如端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶和caspase-3[2]以及信號通路，如TGF-β-smads信號途徑[3]、磷脂酰肌醇3激酶/PKB信號通路[4]等均參與了瘢痕增生的過程。近期的研究表明，在其他人體組織中，成纖維細胞增殖，分化和細胞外基質(zhì)合成過程中發(fā)揮重要作用的信號通路，都有miRNA的調(diào)節(jié)作用出現(xiàn)。有研究證實，在體外培養(yǎng)的IMR-90細胞系中，施加TGF-β可下調(diào)miR-29的表達，繼發(fā)效應為磷脂酰肌醇3-激酶和蛋白激酶B的磷酸化水平上調(diào)；miR-29還通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B信號途徑的磷酸化，下調(diào)Ⅰ型膠原蛋白A鏈(細胞外基質(zhì)成分)的表達。該途徑對于IMR-90細胞的增殖及肺纖維化過程發(fā)揮重要作用[5]。在對肺成纖維細胞中Wnt/β連環(huán)蛋白信號通路的研究結(jié)果顯示，miR-29a起到了類似的作用[6]。Suh等[7]研究發(fā)現(xiàn)，miR-29a的靶基因編碼膠原和細胞外基質(zhì)蛋白成分，并且與細胞進入增殖周期相關(guān)。在對膠質(zhì)細胞瘤患者病變組織與正常組織樣品中的研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞因子受體3 (fibroblast growth factor receptor 3， FGFR3) 有非常高的表達，與之對應的是miR-100的表達水平非常低，二者表達水平呈負性相關(guān)[8]。芯片和生物信息學分析表明，miR-100結(jié)合在FGFR3 mRNA的3′-UTR 端，從而抑制其翻譯。Bi等[9]研究顯示，在骨肉瘤(osteosarcoma，OS)中，癌細胞內(nèi)過度表達的miR-100降低了FGFR3蛋白表達水平，抑制了腫瘤細胞生長，分化和化療敏感性，而抑制miR-100表達起到了相反的結(jié)果。miR-181家族成分被證實常常過度表達于人類腫瘤細胞[10]。有研究表明，在乳腺癌細胞中，miR-181表達水平受TGFβ調(diào)節(jié)，并以此調(diào)節(jié)細胞的侵蝕性生長和遷移，這一生長模式與瘢痕疙瘩類似[11]。瞿連喜等發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細胞內(nèi)miR-181的過度表達促進了癌細胞的增殖。結(jié)合以上結(jié)論，我們分析，miR-181的表達水平與腫瘤細胞增殖呈現(xiàn)正性相關(guān)，與我們的實驗結(jié)果一致，說明瘢痕組織內(nèi)的miR-181表達水平升高可能是引起瘢痕細胞增生的因素之一。miR-198被發(fā)現(xiàn)其高表達與細胞增殖的抑制效應有關(guān)[12]。Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌癌細胞系中，過度表達的miR-198降低了其靶基因巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(fucosyl transferase 8， FUT8)的表達，同時細胞的增殖，轉(zhuǎn)移和侵襲性生長均受到抑制。而作用機制同樣是miR-198結(jié)合于FUT8的mRNA3′-UTR端，從而抑制其翻譯，進而下調(diào)其表達水平。 Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-198抑制周期素D2(Cyclin D2, CCND2)基因翻譯。CCND2表達產(chǎn)物是細胞周期推進的重要調(diào)節(jié)因素之一，miR-198過度表達，抑制CCND2翻譯蛋白水平，導致細胞周期停滯于G1期，增殖受阻。這一結(jié)論與我們的實驗結(jié)果相反。我們分析，就瘢痕增殖而言，是一個多因子，多環(huán)節(jié)參與的過程，在瘢痕疙瘩的形成過程中，miR-198并未發(fā)揮主導作用。

我們的研究證實了從正常皮膚組織、非增生性瘢痕至瘢痕疙瘩，miRNA 的表達譜存在明顯差異，且差異表達明顯的部分miRNA相對表達量呈線性改變，生物信息學及文獻報道證實這些miRNA 對機體其他組織成纖維的增殖和細胞外基質(zhì)合成有明顯調(diào)節(jié)作用，說明miRNA對瘢痕增生的作用是可能是多基因綜合影響的結(jié)果。而這些作用的模式，諸如靶基因的預測和驗證實驗尚需進一步研究。

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Expression of miRNA in skin scar tissue

YANGPing,WUXiao-li,ZHOUYi-qun,ZHUJing-jing,GUOYu,CHENLiang,YANGQing-jian,LUYong-zhou,JIAChuan-long,LIUTian-yi.

(DepartmentofPlasticSurgery,HuadongHospitalofShanghaiFudanUniversity,Shanghai200040,China)

LIUTian-yi,Email:yangwesternblot@126.com

Objective To research the expression of several kinds of miRNA in normal skin, non-hypertrophic scar and keloid, and try to find some special kinds of miRNA that express differently in the three kinds of tissues. Methods miRNA array was used to detect the expression of miRNA in normal skin tissue (C), non-hypertrophic scar (T1) and keloid (T2), and the miRNAs of each group were compared to screen the miRNA which were co-expressed but with differentiated expression. Furthermore, the miRNA with one of the more obvious differences in expression was chosen. Then quantitative Real-Time PCR was used to verify the remarkable expression of miRNA. Results In total, 2539 miRNA were detected, the differential expression results: T1/C, up-regulation 2/down-regulation 17；T2/C, up 3/ down 94；T2/T1, up 9/ down 87. From C, T1to T2, miR29a expression showed a downward trend, and miR181a, and miR198 expression showed an upward trend. Conclusion The expression of miRNA in non-hypertrophic scar and keloid was different from that in normal skin tissue. The miR29a，miR181a and miR198 play an important role in the signal pathways that affect the proliferation and collagen synthesis of fibroblasts in hypertrophic scar tissue. Scar hyperplasia is the result of the expression of multiple genes.

miRNA; Normal skin tissue; Non-hypertrophic scar; Keloid; Scar hyperplasia

上海市衛(wèi)計委面上項目科研基金(20124302);華東醫(yī)院骨干人才培養(yǎng)基金(HDGG2014009) 作者單位：200040 上海，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形美容科(楊 平, 周軼群, 朱晶晶, 郭 妤, 陳 亮, 楊清建, 盧勇舟, 賈傳龍, 劉天一);上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 整復外科(武曉莉) 第一作者：楊 平(1978-)，男，山東濰坊人，主治醫(yī)師，碩士. 通信作者：劉天一，200040，復旦大學附屬華東醫(yī)院 整形美容科，電子信箱：yangwesternblot@126.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.07.020

R619.6

A

1673-7040(2016)07-0443-05

2016-03-11)