周亞麗，郭向華，邵莉，王少春，陳東風(fēng)

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島 266003;2 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

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類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞中miR-146a及miR-155的表達(dá)變化

周亞麗1，郭向華2，邵莉2，王少春2，陳東風(fēng)2

(1青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東青島 266003;2 濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 探討miR-146a及miR-155在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)情況。方法 RA患者30例(RA組)，其中活動(dòng)期22例、非活動(dòng)期8例，正常對照組10例。提取外周血分離單核細(xì)胞，提取microRNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-146a及miR-155的表達(dá)，以小分子RNA U6作為內(nèi)參，計(jì)算microRNA的相對表達(dá)量，以2-ΔΔCT表示。 結(jié)果 RA組及正常對照組外周血單核細(xì)胞中miR-146a的相對表達(dá)量分別為5.99±5.27、3.19±4.24，兩組比較，t=-2.335，P<0.05；miR-155的相對表達(dá)量分別為0.009±0.005、0.010±0.005，兩組比較，t=0.091，P>0.05。miR-146a在RA活動(dòng)期患者及非活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞中的相對表達(dá)分別為 0.607±0.185、0.225±0.006， 兩組比較，t=2.455，P<0.05；miR-155在RA活動(dòng)期及非活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞中的相對表達(dá)分別為 0.008±0.005、0.010±0.005，兩組比較，t=0.154，P>0.05。結(jié)論 RA患者外周血單核細(xì)胞中miR-146a異常高表達(dá)，而miR-155的表達(dá)未見升高。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；外周血單核細(xì)胞；miRNA-146a；miRNA-155

microRNA(miRNA)是一類來源于內(nèi)源性染色體的非編碼單鏈小RNA，長21～25個(gè)核苷酸。盡管miRNA所含堿基較少，但其在固有免疫、炎癥反應(yīng)及腫瘤發(fā)生等各種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。目前已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iRNA在腫瘤中的表達(dá)情況。miRNA在甲狀腺癌、鼻咽癌、食管癌中呈高表達(dá)[1～3]，在結(jié)腸癌中呈低表達(dá)[4]。目前在自身免疫系統(tǒng)疾病中研究miRNA者較少。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種最為常見的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)慢性滑膜炎癥為特征，在發(fā)病兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆關(guān)節(jié)損害[5～7]。本研究觀察了早期類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血單核細(xì)胞中miR-146a及miR-155的表達(dá)情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2014年10月～2015年5月來自濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院門診及住院RA患者30例(RA組)，均符合2009年美國風(fēng)濕病協(xié)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)和評分系統(tǒng)。男8例、女22例，年齡18～68歲，病程1～24個(gè)月、中位病程4.5個(gè)月，排除其他結(jié)締組織疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、骨關(guān)節(jié)炎、冠心病、高血壓、糖尿病、妊娠及哺乳期婦女等。根據(jù)患者28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評分系統(tǒng)將RA患者分為活動(dòng)期及非活動(dòng)期，30例患者中活動(dòng)期22例、非活動(dòng)期8例。正常對照組10例，為健康志愿者，男1例、女9例，年齡23～52歲，無關(guān)節(jié)炎的相關(guān)癥狀及體征。

1.2 外周血單核細(xì)胞miR-146a及miR-155表達(dá)的檢測 收集RA患者及正常人外周血9 mL，分離外周血單核細(xì)胞。采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測miR-146a及miR-155的相對表達(dá)量。核酸提?。涸跐崈舻?.5 mL的離心管中加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，取抗凝血0.5 mL混勻。室溫靜置10 min。以5 000 r/min 離心5 min，棄上清，收集底部的細(xì)胞。再次重復(fù)上述兩個(gè)步驟一遍。向細(xì)胞中加入1 mL TRIzol，反復(fù)吹打直至沉淀完全溶解，室溫靜止5 min。加入0.2 mL氯仿，振蕩均勻。14 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，吸取上清層轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中。加入等體積的異丙醇，上下充分混勻，室溫靜置10 min。14 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，棄上清，加入75%乙醇1 mL，輕輕上下顛倒洗滌管壁。14 000 r/min、4 ℃ 離心5 min，棄乙醇。室溫干燥10～15 min，加入20 μL RNase-free 水溶解沉淀。逆轉(zhuǎn)錄：miRNA 3′末端進(jìn)行加Poly (A)處理：在冰上預(yù)冷RNase Free的反應(yīng)管內(nèi)加入Total RNA 8 μL、E.coli Poly(A) Polymerase(5 U/μL) 0.4 μL、10×Poly(A) Polymerase Buffer 2 μL、5×rATP Solution 4 μL、RNase-Free ddH2O 5.6 μL至總體積20 μL。輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37 ℃反應(yīng)60 min。所得的反應(yīng)液可以直接進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。Poly (A)修飾的miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將上述所得反應(yīng)液，按Poly(A)反應(yīng)液2 μL、10×RT Primer 2 μL、10×RT Buffer 2 μL、Super Pure dNTPs (2.5 mmol/L) 1 μL、RNasin (40 U/μL) 1 μL、Quant RTase 0.5 μL、RNase-Free ddH2O 11.5 μL的方法進(jìn)行配制，用于合成第一鏈cDNA。輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，短暫離心后在37 ℃反應(yīng)60 min。合成的cDNA反應(yīng)液可放置于-20 ℃保存。熒光定量:相關(guān)正向引物序列：hsa-miR-146a-5p qPCR Primer：5′-AGAACUGAAUUCCAUGGGUU-3′;hsa-miR-155-5p qPCR Primer：5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′;U6 F 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;U6 R 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR配制體系：2×miRcute miRNA Premix 10 μL、F(10 μmol/L)0.4 μL、R(10 μmol/L) 0.4 μL、第一鏈cDNA 2 μL、50×ROX Reference Dye 1.6 μL、RNase-Free ddH2O 5.6 μL。qPCR反應(yīng)程序：94 ℃、2 min,1個(gè)循環(huán)。94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)。在ABI 7500熒光定量PCR儀器上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)結(jié)束后做熔解曲線分析。計(jì)算各標(biāo)本平均Ct值，以小分子RNA U6作為內(nèi)參，miR-146a及miR-155的Ct值減去U6 Ct值為ΔCT值。miRNA的相對表達(dá)量用2-ΔΔCT表示[8]。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血單核細(xì)胞miR-146a、miR-155的相對表達(dá)量比較RA組及正常對照組外周血單核細(xì)胞中miR-146a的相對表達(dá)量分別為5.99±5.27、3.19±4.24，兩組比較，t=-2.335，P<0.05；miR-155的相對表達(dá)量分別為0.009±0.005、0.010±0.005，兩組比較，t=0.091，P>0.05。

2.2RA活動(dòng)期及非活動(dòng)期患者mi-146a及miR-155的相對表達(dá)量比較miR-146a在RA活動(dòng)期患者及非活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.607±0.185、0.225±0.006，兩組比較，t=2.455，P<0.05；miR-155在RA活動(dòng)期及非活動(dòng)期患者外周血單核細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.008±0.005、0.010±0.005，兩組比較，t=0.154，P>0.05。

3 討論

miRNA廣泛存在于哺乳動(dòng)物、線蟲、植物及病毒中，是一種可調(diào)節(jié)基因表達(dá)、調(diào)節(jié)生長發(fā)育、維持機(jī)體正常生理功能的一類重要的非編碼RNA，其命名規(guī)則為miR-#，#為阿拉伯?dāng)?shù)字。高度同源的miRNA，則在阿拉伯?dāng)?shù)字后面加上小寫字母，如miR-146a、miR-146b、miR-196a、miR-196b等。

Pauley等[9]發(fā)現(xiàn)，miR-146a、miR-155在RA患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)均顯著高于正常對照組，其表達(dá)倍數(shù)分別為2.6倍及1.8倍。并將患者根據(jù)C反應(yīng)蛋白及紅細(xì)胞沉降率分為活動(dòng)期及非活動(dòng)期，發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期患者miR-146a表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期患者。Stanczyk等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146a在RA成纖維細(xì)胞中的表達(dá)顯著高于對照組骨關(guān)節(jié)炎患者，但是miR-155在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)與對照組骨關(guān)節(jié)炎患者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。馮知濤等[11]通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測40例RA患者外周血miR-146a及miR-16的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在RA患者中表達(dá)水平顯著高于健康人群，并發(fā)現(xiàn)miR-146a及miR-16在RA活動(dòng)組中表達(dá)水平顯著高于緩解組及正常對照組，認(rèn)為miR-146a及miR-16的表達(dá)水平可作為RA疾病活動(dòng)的有效指標(biāo)。王楷文等[12]發(fā)現(xiàn)，miR-146a在RA活動(dòng)期患者血漿中的表達(dá)水平明顯高于非活動(dòng)期。尹志華等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-146a及miR-155在RA患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)分別是正常對照組的1.68倍及1.74倍，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在RA患者外周血漿中miR-146a及miR-155的表達(dá)分別是正常對照組的2.47倍及4.65倍，所以其認(rèn)為血漿中miRNA比外周血單核細(xì)胞中miRNA可以更好地作為RA的生物標(biāo)志物，且還可以作為RA活動(dòng)的預(yù)測指標(biāo)。以上研究表明在RA患者的多種組織中miR-146a及miR-155均異常表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，miR-146a在RA患者外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)高于正常對照組，是正常對照組的1.87倍，且miR-146a在RA活動(dòng)期患者中的表達(dá)高于非活動(dòng)期患者，與上述研究結(jié)果類似，其表達(dá)上調(diào)可能與RA發(fā)病機(jī)制有關(guān)，但是miR-155的表達(dá)于RA組及正常對照組之間及RA活動(dòng)期患者與非活動(dòng)期患者之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與種族、實(shí)驗(yàn)條件、所選患者及患者例數(shù)有關(guān)。Taganov等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在受到脂多糖刺激時(shí)，人類單核細(xì)胞中miR-146a表達(dá)上調(diào)。上調(diào)的miR-146a作用于腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶，這兩種蛋白都是Toll樣受體和細(xì)胞因子信號(hào)通路中重要的信號(hào)蛋白，miR-146a通過抑制上述兩種靶蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對Toll樣受體信號(hào)通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)，從而防止炎癥反應(yīng)過激。

理想的miRNA標(biāo)志物是在患者血液中呈中等或者高水平表達(dá)，而在健康人群血液中檢測不到或者呈低水平表達(dá)。本研究結(jié)果雖然可以證實(shí)miR-146a的表達(dá)在RA患者和正常人群中的差異，miR-146a可能是RA的潛在預(yù)后預(yù)測指標(biāo)，但是若想確定其是否可以作為RA診斷指標(biāo)，尚需擴(kuò)大入選患者數(shù)量進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步闡明miR-146a在RA發(fā)病機(jī)制中的可能作用，并且需要在其他結(jié)締組織疾病中驗(yàn)證。而miR-155在RA中的表達(dá)情況仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013WS0338)；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院苗圃科研項(xiàng)目(JYFY-MP-2013-MS-008)。

陳東風(fēng)(E-mail:37691289@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.026

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1002-266X(2016)45-0077-03

2016-08-18)