康玉霞，雷　丸，王　瑩，郭飛燕，王曉娟*

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·藥學(xué)研究·

紅凈膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

康玉霞1,2，雷丸2，王瑩2，郭飛燕2，王曉娟2*

1.陜西中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，咸陽 712046；2.軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科，西安 710032

[摘要]目的建立紅凈膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用顯微鑒別法鑒別本制劑中的冰片和三七；采用薄層色譜法(TLC)鑒別丹參、冰片和三七；采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定沙利度胺的含量，色譜柱為Inertsustain C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm。結(jié)果在選定的薄層色譜條件下，斑點(diǎn)顯色清晰，分離效果良好。沙利度胺濃度在40.32～141.12 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系(r=0.999 8)；平均回收率為98.27%，RSD為1.44%(n=9)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便可行，專屬性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，可用于紅凈膠囊的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞]紅凈膠囊；薄層色譜法；高效液相色譜法；沙利度胺

0　引言

紅斑是真皮乳頭層毛細(xì)血管網(wǎng)局限性或全身性擴(kuò)張而產(chǎn)生局部或全身性的紅色斑疹，又稱紅斑狼瘡(Lupus erythematosus，LE)。LE是一種環(huán)境、基因和免疫等多種因素作用下的自身免疫疾病[1-2]，臨床上表現(xiàn)為多系統(tǒng)損害，有較高的發(fā)病率和死亡率，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜[3-4]。由第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院研制的復(fù)方制劑紅凈膠囊具有活血化瘀、清心除煩之功效。本制劑由沙利度胺、丹參、冰片、三七等組成，沙利度胺為本制劑的主要藥效成分，具有治療多發(fā)性紅斑、紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)性紅斑等功效。為控制藥品質(zhì)量，保證藥品療效，筆者對(duì)紅凈膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，采用顯微鑒別法、薄層色譜法對(duì)冰片、三七和丹參進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法對(duì)沙利度胺進(jìn)行含量測(cè)定，建立可控制該制劑質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

1　儀器與試藥

數(shù)碼顯微鏡(DMBH200，目鏡×20倍、物鏡×10倍，系統(tǒng)自帶成像系統(tǒng)，寧波舜宇儀器有限公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ5200E型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)；十萬分之一電子天平(BT125D，德國(guó)賽多利斯公司)；丹參酮ⅡA對(duì)照品(批號(hào)：110766-200417，純度：100%)、冰片化學(xué)對(duì)照品(批號(hào)：110743-200905，純度：100%)、人參皂苷Rb1對(duì)照品(批號(hào)：110704-201424，純度：93.7%)、人參皂苷Rg1對(duì)照品(批號(hào)：110703-201128，純度：93.4%)、三七皂苷R1對(duì)照品(批號(hào)：110745-200617，純度：100%)、沙利度胺對(duì)照品(批號(hào)：130504-200501，純度：100%)，均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；紅凈膠囊(規(guī)格：220 mg/粒，12粒×2板/盒；批號(hào)：140915、141021、141211，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科)；丹參陰性樣品、冰片陰性樣品、三七陰性樣品、沙利度胺陰性樣品，均為實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水。

2　方法與結(jié)果

2.1顯微鑒別取冰片粉末適量置于載玻片上，滴加水合氯醛2～3滴，酒精燈加熱至水合氯醛半干為止，加熱時(shí)輕輕晃動(dòng)載玻片，以免將水合氯醛蒸干。然后加稀甘油1滴，蓋上蓋玻片，趕走氣泡，將制備好的冰片粉末切片置于顯微鏡下觀察?？梢姷矸哿６?，呈單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm，草酸鈣簇晶稀少，樹脂道破裂并含有黃色分泌物，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或裂縫狀，復(fù)粒由2～10余分粒組成。再取三七粉末適量，按照冰片的粉末制片方法制備三七粉末切片，置于顯微鏡下觀察，可見棒狀或多角形結(jié)晶，見圖1。另取紅凈膠囊內(nèi)容物適量，按照冰片的粉末制片方法制備供試品的粉末切片，置于顯微鏡下觀察。可見：①淀粉粒多，呈單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm，臍點(diǎn)點(diǎn)狀或裂縫狀，復(fù)粒由2～10余分粒組成；②棒狀或多角形結(jié)晶。見圖2。通過冰片、三七藥材和供試品的顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)供試品的顯微特征基本上與冰片和三七的顯微特征相似，由此可判定供試品中含有冰片和三七。

2.2薄層色譜鑒別

2.2.1丹參、冰片的TLC鑒別取本品10粒，加乙醚15 mL，超聲5 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL復(fù)溶，作為供試品溶液。再取丹參酮ⅡA、冰片的對(duì)照品適量，分別加乙酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的對(duì)照品溶液。另取丹參陰性樣品和冰片陰性樣品按供試品的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。吸取供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μL、對(duì)照品溶液5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以甲苯∶乙酸乙酯(19∶1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與丹參酮ⅡA對(duì)照品色譜相對(duì)應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖3；噴以1%的香草醛硫酸溶液，105 ℃加熱數(shù)分鐘，在與冰片對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖4。

2.2.2三七的TLC鑒別取本內(nèi)容物2 g，加水?dāng)?shù)滴潤(rùn)濕，再加水飽和的正丁醇15 mL，密塞，超聲10 min，放置2 h，分取正丁醇層，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL,合并正丁醇層，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状? mL復(fù)溶，作為供試品溶液。再取人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品及三七皂苷R1對(duì)照品適量，分別加甲醇制成每1 mL含1 mg的對(duì)照品溶液。另取三七陰性樣品按供試品的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)在同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水(13∶7∶2)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾，見圖5。

圖1　冰片、三七顯微鑒別

圖2　紅凈膠囊顯微鑒別

圖3　丹參的TLC鑒別圖譜

圖4　冰片的TLC鑒別圖譜

圖5　三七的TLC鑒別圖譜

2.3含量測(cè)定

2.3.1色譜條件[5]色譜柱：Inertsustain C18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(15∶85，v/v)；檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm；流速：1.0 mL/min。

2.3.2溶液的制備對(duì)照品溶液的制備：精密稱取沙利度胺對(duì)照品5.05 mg，置5 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度，搖勻，得1.01 mg/mL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取該對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.10 mg/mL的對(duì)照品溶液。供試品溶液的制備[6]：取紅凈膠囊10?；旌暇鶆颍芊Q取0.18 g，置25 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲處理30 min，取出，放冷，加乙腈定容至刻度。精密量取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻。陰性對(duì)照溶液的制備：取沙利度胺陰性樣品適量，按上述方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3.3專屬性試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，供試品溶液與對(duì)照品溶液保留時(shí)間一致，陰性對(duì)照溶液在沙利度胺相應(yīng)的保留時(shí)間未出現(xiàn)色譜峰，表明在該色譜條件下沙利度胺的吸收良好，紅凈膠囊中的其他成分對(duì)沙利度胺的測(cè)定無干擾。色譜圖見圖6。

圖6　沙利度胺HPLC色譜圖

2.3.4線性關(guān)系考察精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相定容至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度分別為40.32、60.48、80.64、100.8、120.96、141.12 μg/mL的對(duì)照品系列溶液。精密吸取上述對(duì)照品系列溶液各10 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以沙利度胺對(duì)照品的峰面積(Y)對(duì)沙利度胺的進(jìn)樣濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=23 388 X+83 215(r=0.999 8)，表明沙利度胺濃度在40.32～141.12 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5精密度試驗(yàn)精密吸取沙利度胺對(duì)照品溶液(0.10 mg/mL)10 μL，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，并計(jì)算其RSD為0.04%，表明儀器精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10 μL于0、2、4、6、8、10、12 h按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算其RSD為0.26%(n=7)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批紅凈膠囊(批號(hào)：140915)，按照“2.3.2”項(xiàng)下的方法制備6份供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果顯示沙利度胺的平均含量為129.63 mg/g，RSD為1.15%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8加樣回收率試驗(yàn)分別稱取約35 mg已知含量(每克含有沙利度胺約25 mg)的紅凈膠囊內(nèi)容物9份，精密稱定，分別按照高、中、低濃度加入一定量的沙利度胺對(duì)照品，混合均勻，置10 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲30 min，取出，放冷，加乙腈定容至刻度。精密量取上述溶液1 mL于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 μL，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.3.9樣品含量測(cè)定精密稱取3批紅凈膠囊內(nèi)容物，按照“2.3.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備，按照“2.3.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算沙利度胺的含量，結(jié)果見表2。

表1　加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

表2　三批樣品沙利度胺的含量測(cè)定結(jié)果

3　討論

筆者在顯微鑒別中發(fā)現(xiàn)，三七的樹脂道在藥材中稀少而在制劑中并未發(fā)現(xiàn)，因此未把三七的樹脂道鑒別納入標(biāo)準(zhǔn)。此外，本制劑中三七和冰片的鑒別，同時(shí)采用了顯微鑒別法和薄層色譜鑒別法，結(jié)合兩者獨(dú)特的顯微結(jié)構(gòu)和薄層色譜圖，判斷制劑中有三七和冰片的存在，較為科學(xué)合理。

薄層色譜法中制備丹參供試品溶液時(shí)，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，考查了幾種不同的提取方法：加乙醚，振搖，放置1 h；加乙醚超聲30 min；加乙醚超聲10 min；加乙醚超聲5 min；結(jié)果發(fā)現(xiàn)效果無明顯差異，最終選擇了最簡(jiǎn)便易行的方法即加乙醚超聲5 min。

本制劑的定性鑒別中均以各自的陰性對(duì)照進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示無干擾，且方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重現(xiàn)性好，將丹參酮ⅡA和冰片使用同一供試品和展開系統(tǒng)，簡(jiǎn)化了操作，效果較好，可以納入該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

三七的薄層色譜鑒別中，通過查閱藥典[10]和相關(guān)文獻(xiàn)[11-18]，分別考查了幾種不同的展開系統(tǒng)，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置12 h的下層溶液、三氯甲烷-甲酸-水-冰醋酸(14∶11∶2∶0.5)、三氯甲烷-甲醇-水(7∶3∶0.5)、正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1∶5)的上層溶液、三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下層溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)10 ℃以下放置12 h的下層溶液的展開系統(tǒng)中，薄層色譜能呈現(xiàn)斑點(diǎn)整齊、清晰，且Rf值適中的效果，故選擇此展開系統(tǒng)。

沙利度胺為本方的主藥，故筆者在本質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中建立了沙利度胺的含量測(cè)定方法。通過本實(shí)驗(yàn)建立的薄層鑒別方法和高效液相色譜含量測(cè)定方法對(duì)三批樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，發(fā)現(xiàn)本方法簡(jiǎn)便易行，靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于紅凈膠囊的質(zhì)量控制。

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收稿日期：2015-04-16

基金項(xiàng)目：口腔?？铺厣菢?biāo)準(zhǔn)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高研究(14ZJZ06)

*通信作者

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201603020

Quality standard of Hongjing capsule

KANG Yu-xia1,2,LEI Wan2,WANG Ying2,GUO Fei-yan2,WANG Xiao-juan2*

(1.College of Pharmacy,Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Xianyang 712046,China; 2.State Key Laboratory of Military Stomatology,Desect1ment of Pharmacy,School of Stomatology,the Fourth Military Medical University,Xi′an 710032,China)

【Abstract】ObjectiveTo establish the quality standard of Hongjing capsule.MethodsBorneol and radix notoginseng from Hongjing capsule were identified by microscopic identification; Salvia miltiorrhiza,borneol and radix notoginseng were identified qualitatively by TLC; HPLC was adopted to determine the content of thalidomide in the preparation,chromatographic column was Inertsustain C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution (15∶85,v/v)was as mobile phase,and detection wavelength was at 237 nm.ResultsUnder the condition of selected TLC,the spot color was clear and the separation effect was good.Thalidomide showed a good linear relationship in the range of 40.32～141.12 μg/mL with r=0.999 8,and average recovery was 98.27% with RSD 1.44% (n=9).ConclusionThe method is simple and specific with good repeatability and can be used for quality control of Hongjing capsule.

Key words：Hongjing capsule; TLC; HPLC; Thalidomide