孫　娜，陳　黎，劉　序，盧雪佳，邢　磊

（黃山學院 生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041）

香榧種子內含發(fā)芽抑制物對種子萌發(fā)的影響

孫娜，陳黎，劉序，盧雪佳，邢磊

（黃山學院 生命與環(huán)境科學學院，安徽 黃山 245041）

研究了抑制萌發(fā)物質對香榧種子休眠的影響，用GC-MS聯用儀對香榧種子各部分甲醇浸提液進行了生物測定，鑒定香榧種子不同部位所含有機物質的種類。結果表明香榧種子外種皮、內種皮和胚乳的浸提液對白菜種子發(fā)芽率和幼苗的莖、根生長均有抑制作用，抑制強度為：內種皮＞外種皮＞胚乳，且隨浸提液濃度的增大，抑制作用增強。從香榧種子的外種皮、內種皮和胚乳中鑒定出多種有機化合物，并鑒定出物質種類和相對含量。其中包括以亞油酸、亞油酸甲酯、beta-谷甾醇、鄰苯二酚為主的酸類、酯類、醇類、酚類等。香榧種子各部位均含有已確定為發(fā)芽抑制物質的鄰苯二酚，表明香榧種子的外種皮、內種皮和胚乳中均含有抑制種子萌發(fā)物質。

香榧種子；休眠；抑制物質

香榧（Torreya grandis Fort.et Lindl.cv.Merrillii），是一種經濟價值和營養(yǎng)價值較高的干果類樹種，常綠喬木，堅果［1-3］。其種仁含17種氨基酸與19種礦物元素，含油率高達546.2-614.7g·kg-1，并含有極豐富的煙酸和葉酸，且不飽和脂肪酸占脂肪酸的79.41%［4］。是集食用、藥用、油用、材用、觀賞為一體的珍貴干果樹種。目前關于香榧的研究主要集中在起源、假種皮成分分析以及種植栽培等方面［5］，但對香榧種子休眠、催芽、種子萌發(fā)及苗木培育等方面少有報道。對香榧種子各部位甲醇浸提液進行生物測定及GC-MS鑒定，探究種子中發(fā)芽抑制活性物質的種類、相對含量，研究香榧種子休眠、萌發(fā)為苗木培育提供理論依據。

1　材料來源

香榧種子于2013年10月采集于黃山區(qū)湯口鎮(zhèn)湯口村山地。供試香榧種子樹齡80a，水洗后除去假種皮、室內自然晾干后于4℃冰箱備用，種子千粒重4128.88g；生物測定所用白菜種子為市售536白菜種子，純度96%、凈度98%、含水量≤7%、發(fā)芽率≥85%。

2　實驗方法

2.1香榧種子各部分甲醇浸提液的生物測定

將香榧種子分離為外種皮、內種皮和胚乳3部分，各取10g置于研缽中，研磨后用80%甲醇50ml，放置4°C環(huán)境下浸提48h，重復2次，將2次濾液混合，在35°C條件下蒸干濃縮，用蒸留水定容至20ml為原液。再分別稀釋為原液的10%、20%、40%、60% 和100%，貯于5°C下備用。抑制活性的生物測定參照趙敏等的方法［6］。分別取上述不同濃度的浸提液5ml置于燒杯中進行測定，以同體積蒸餾水為對照，每處理3個重復，每個重復100粒白菜種子，48h后統(tǒng)發(fā)芽的白菜種子數。然后在25°C、12h光照、75%濕度、1200lx人工氣候箱中培養(yǎng)，72h后分別測出根和莖的長度。

2.2香榧種子發(fā)芽抑制物的鑒定

2.2.1測定樣品的制備

將香榧種子的外種皮、內種皮和胚乳進行分離，各取分離物10g研磨后用80%甲醇浸提，重復2次，將濾液混合后在35°C下減壓濃縮蒸干。然后再用甲醇將其定容至5ml，即得到甲醇提取物的濃縮樣品。用于GC-MS測試。

2.2.2GC-MS分析

測定儀器為美國Agilent公司生產的（Agilent HP7890-5975C）氣相-質譜連用儀，其載氣為高純He，體積流量設為1mLmin-1；采用HP-5MS彈性石英毛細管柱 30mx250μmx0.25μm。起始溫度為40°C測定3分鐘，接著是4°Cmin-1到160°C測定3分鐘，后6°Cmin-1到285°C測定10分鐘。進樣溫度280°C，進樣量1μl。最后由計算機控制的庫存信號檢索各個成分的質譜圖并參考保留值。

2.2.3發(fā)芽抑制物相對含量的測定

以離子流程圖中每個峰面積與全部峰面積的比值代表該物質的相對含量。

3　結果與分析

3.1香榧種子各部分發(fā)芽抑制物質對白菜種子生長的影響

由圖1可以看出，各處理對白菜種子的萌發(fā)均有抑制作用，外種皮、內種皮和胚乳均隨著浸提液濃度的增加，白菜種子的發(fā)芽數呈逐漸降低的趨勢，其中內種皮的抑制作用最強。當浸提液濃度升高到80%時，白菜發(fā)芽數為零。對不同部位不同濃度的發(fā)芽抑制物質對白菜種子生長的影響進行方差分析，結果表明各部位各濃度下的白菜種子發(fā)芽數存在極顯著差異。白菜種子在外種皮、內種皮，胚乳浸提液濃度為10%時發(fā)芽最多，分別為 65.2%，34.15，47.3%，均明顯低于對照組 92%，抑制作用表現為：內種皮＞胚乳＞外種皮，且隨著浸提液濃度的增大抑制作用增強。表明不同部位的浸提液抑制作用差異顯著，相同部位不同濃度間的抑制作用也有顯著性差異。

圖1　香榧種子各部位內含物質不同濃度甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽的影響

用香榧種子不同部位不同濃度的浸提液對白菜種子萌發(fā)及胚根的生長影響情況進行方差分析，由圖2可知，外種皮、內種皮以及胚乳的不同濃度浸提液對白菜種子胚根、莖長的生長均有抑制作用且差異顯著，并隨濃度的升高抑制作用加強，其中內種皮的抑制作用最強，外種皮和胚乳的抑制作用相近。0.1mgL-1的內種皮浸提液與對照組相比，胚根的生長速度減半，抑制作用達到極顯著水平。0.6mgL-1的外種皮、胚乳、內種皮的抑制作用依次增強，胚根長分別為5.2mm、3.2mm、2.6mm均小于對照組胚根長16.2mm，濃度升高到0.8mgL-1時，胚根不再生長。

圖2　香榧種子不同部位內源物質對白菜根生長的作用

圖3　香榧種子不同部位內源物質對白菜莖生長的作用

由圖3看出，莖的生長在濃度為10%時，抑制作用不明顯，隨濃度的增大，抑制作用明顯加強，表現為內種皮＞外種皮＞胚乳。方差分析結果表明，外種皮10%、胚乳10%、20%甲醇浸提液的莖長生長與對照相比沒有顯著差異，而其他各處理組間差異均達到顯著或極顯著水平。浸提液濃度最大時抑制作用達到最強，莖長為0，表明不同部位不同濃度、相同部位不同濃度間所含發(fā)芽抑制物的抑制作用不同且差異顯著。

3.2香榧種子各部位中有機化合物種類及相對含量

3.2.1香榧種子外種皮中有機化合物種類及相對含量

采用GC-MS分析法鑒定了香榧種子外種皮甲醇萃取液，共分離出87個峰。選擇相似度較大相對含量較高的有機化合物8種，通過計算機檢索出化合物的有關信息（見表1），其中已確定有抑制作用的是鄰苯二酚（0.99%），香榧外種皮中其他含量較大的為：未知1（7.11%）、beta-谷甾醇相對含量6.93%、油酸甲酯相對含量4.23%、亞油酸甲酯相對含量2.18%；但對上述物質是否存在抑制活性，還需用標準品進一步確定。

表1　香榧種子中有機化合物種類及相對含量

3.2.2香榧種子內種皮中有機化合物種類及含量

從香榧種子內種皮甲醇萃取液，得到總離子流程圖，分離出48個峰，選擇離子流程圖中相似度較大相對含量較高的有機化合物8種（見圖4）。

由表1可知，香榧內種皮中含量較大的為亞油酸甲酯（17.63%）、油酸甲酯（12.22%）、beta-谷甾醇（12.24%）、4，5，6，7-四氯鄰苯二甲酰亞胺 （11.02%）、鄰苯二酚 （1.01%）。除此之外棕櫚酸、3，4-二氫-2，5，8-三甲-2-2H-1-苯并吡喃-6-醇等物質也可能存在發(fā)芽抑制活性，但是否有抑制作用作用還需要用標準品進一步驗證。

3.2.3香榧種子胚乳中有機化合物種類及含量

香榧種子胚乳的甲醇提取物中得到的有機化合物約10種（見表1），香榧胚乳中相對含量較大的有3，4-二氫-2，5，8-三甲-2-2H-1-苯并吡喃-6-醇，相對含量為7.63%，未知3，相對含量為9.06%，未知2，相對含量為5.21%，beta-香樹精，相對含量為2.17%，油酸相對含量1.65%、亞油酸相對含量1.21%。相對含量為1.76%。未知物質有無抑制作用，需要進一步研究。

4　結論與討論

對香榧種子進行生物測定，表明香榧種子外種皮、內種皮和胚乳甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽及莖根長生長均有抑制作用。外種皮和胚乳的低濃度浸提液對白菜種子莖長的影響差異不顯著，其他各處理均達到顯著抑制水平。其中內種皮甲醇浸提液對白菜種子的發(fā)芽和生長均表現極顯著抑制作用，抑制物質可能主要存在于內種皮中。

有關研究表明，內源抑制物質的存在是植物種子休眠的主要原因［7］，內源抑制物是指植物種子的種皮或其他部位存在某種或某些能夠阻礙種子生理活動或某個代謝環(huán)節(jié)的物質，種子必須經過一定時間，待這些化學物質分解后才能解除抑制作用而萌發(fā)［8］。種子在后熟過程中是否起作用也有待于進一步研究。結合種子研磨液的浸提、GC-MS鑒定從香榧種子外種皮、內種皮、胚乳3個部位的甲醇浸提液中分離鑒定出多種物質，包括以亞油酸為主的有機酸類、亞油酸甲酯為主的酯類、鄰苯二酚為主的酚類、beta-谷甾醇為主的醇類等，這與張艷杰等［9］在南方紅豆杉種子透性及甲醇浸提液的生物測定一文中的研究結果極為相似。此外，3個部位中均含有發(fā)芽抑制物質鄰苯二酚，這與韓東等［10］在對西洋參種子中發(fā)芽抑制物質的研究結果一致。研究表明，香榧種子外種皮、內種皮以及胚乳的內含物的抑制作用有著很大的差異，這種差異可能是由種子各部分所含的抑制物種類及含量有所不同引起的。在香榧種子各部位中均含有發(fā)芽抑制物質鄰苯二酚，但其抑制作用明顯不同，可能是因為同種物質的含量不同對種子發(fā)芽產生不同影響。

GC-MS鑒定的結果表明，香榧種子的中種皮、內種皮及胚乳中存在著種類不盡相同、抑制強度各異的萌發(fā)抑制物質，說明內源抑制物種類具有多樣性，但在種子內哪一種或幾種起抑制作用還有待于進一步研究。

［1］武棟.安徽徽州榧樹種群內種子理化性質的分析［D］.杭州：浙江農林大學，2012：8-13.

［2］梁淑云，丁之恩，胡文翠.安徽香榧資源概況及栽培技術［J］.經濟林研究，2006，24（2）：59-62.

［3］沈登鋒，曾燕如，喻衛(wèi)武，等.榧樹種質資源的收集與種子理化性質的初步分析 ［J］.浙江農林大學學報，2011，28（5）：747-752.

［4］黎章矩，駱成方，程曉建，等.香榧種子成分分析及營養(yǎng)評價［J］.浙江林學院學報，2005，22（5）：540-544.

［5］黎章矩，程曉建，戴文圣，等.香榧品種起源考證［J］.浙江林學院學報，2005，22（4）：443-448.

［6］趙敏，王炎，張偉.北五味子內源抑制物質特性的初步研究［J］.東北林業(yè)大學學報，1991，27（5）：62-64.

［7］黃耀閣，崔樹玉，楊繼祥，等.野生藥用植物種子休眠的成因及解決的途徑［J］.吉林農業(yè)大學學報，1993，（1）：203-207.

［8］黃丹，徐岳香，胡海波.植物種子休眠原因與機理的研究進展［J］.亞熱帶植物科學，2010，9（2）：78-83.

［9］張艷杰，高捍東，魯順保.南方紅豆杉種子透性及甲醇浸提液的生物測定［J］.江西農業(yè)大學學報，2007，29（3）：384-389.

［10］韓東，李向高，黃耀閣，等.西洋參果實不同部位發(fā)芽抑制物質的研究［J］.特產研究，2011，（2）：13-18.

責任編輯：胡德明

The Effects of Germination Inhibitors Contained in Torreya grandis Seeds on Seed Germination

Sun Na，Chen Li，Liu Xu，Lu Xuejia，Xing Lei
（School of Life and Environmental Sciences，Huangshan University，Huangshan 245041，China）

The influence of germination inhibiting substances on Torreya seeds dormancy is studied. Biological determination on the methanol extract from different parts of Torreya grandis seeds is conducted by GC-MS in order to determine the type of organic matters contained in different parts of Torreya grandis seeds.The results show that the testa，inner seed coat and endosperm extraction liquid can inhibit the germination rate of cabbage seeds and the growth of seedling stems and roots.The inhibitory strength is like this：endotesta＞exosperm＞endosperm.The inhibition enhances with the increase of the concentration of the leaching solution.From the testa，inner seed coat and endosperm extraction liquid of Torreya seeds，a variety of organic compounds are identified.And the type and relative content of the substances are identified，among which acids，esters，alcohols and phenols such as linoleic acid，linoleic acid methyl ester，beta sitosterol and catechol are included.Catechol which has been identified as a germination inhibitor contains in each part of Torreya seeds.The results show that inhibiting seed germination substances are contained in the exotesta，inner seed coat and endosperm of Torreya seeds.

Torreya seeds；dormancy；inhibiting substances

S3

A

1672-447X（2016）03-0044-004

2016-03-15

國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201539）；安徽省質教育廳量工程項目（201502）；黃山學院自然科學研究項目（2014xkj001）

孫娜（1993-），安徽淮北人，黃山學院生命與環(huán)境科學學院學生，研究方向為森林培育；陳黎（1965-），安徽金寨人，黃山學院生命與環(huán)境科學學院副教授，研究方向為植物栽培。