吳麗萍，朱　妞，李　慧，王東生

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山245041）

超聲波輔助酶法提取苦瓜素工藝研究

吳麗萍，朱妞，李慧，王東生

（黃山學(xué)院 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，安徽 黃山245041）

采用超聲波輔助酶法對(duì)苦瓜中苦瓜素的提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果顯示，苦瓜素的最佳提取工藝條件為料液比1∶10、復(fù)合酶用量0.25%，提取時(shí)間60min、提取溫度55℃、超聲波功率200W，在此條件下，苦瓜素提取率為16.82%。超聲波輔助酶法應(yīng)用于苦瓜素的提取，高效環(huán)保，可為苦瓜素的工業(yè)化提取提供理論參考。

超聲波；酶；苦瓜素；提取

苦瓜（momordica charantial），葫蘆科苦瓜屬，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用植物，因其含有羅漢果苷和苦瓜素等成分而呈甘苦味［1］。近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)苦瓜的研究已成為熱點(diǎn)課題，關(guān)于苦瓜的功效成分及保健功能更是進(jìn)行了大量的研究。結(jié)果表明苦瓜富含苦瓜多糖、苦瓜素、苦瓜皂苷、類(lèi)黃酮化合物、生物堿等多種功效成分，具有降血糖、抗癌、抗病毒、抗生育、增強(qiáng)免疫力等功能特性［2］。目前關(guān)于苦瓜多糖、苦瓜皂苷的報(bào)道較多，而關(guān)于苦瓜素的研究卻鮮有報(bào)道?？喙纤厥且活?lèi)Ⅱ型（單鏈）核糖體失活蛋白，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有6種苦瓜素，目前研究較多的為α、β、γ、δ-苦瓜素等，藥理試驗(yàn)證明，苦瓜素具有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、減肥等功效［3］。關(guān)于苦瓜素的提取研究通常采用的方法是堿提醇沉工藝，但堿液提取苦瓜素時(shí)會(huì)產(chǎn)生較深不良色澤［4］，給產(chǎn)品質(zhì)量一定影響。因此，本文采用超聲波輔助酶法苦瓜素工藝進(jìn)行優(yōu)化，在一定程度上提高苦瓜素提取率，對(duì)擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域及工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的現(xiàn)實(shí)意義及參考價(jià)值。

1　材料與方法

1．1材料與儀器

鮮苦瓜：市售；纖維素酶（15000U/g）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；果膠酶（20000U/g）：合肥一力生物技術(shù)有限公司；三氯乙酸（TCA），氯化鈉，冰乙酸，高氯酸，氫氧化鈉，酒石酸甲鈉，亞硫酸鈉，葡萄糖，檸檬酸鈉，95%乙醇（以上試劑均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)上海試劑公司）。

SY-1000E多用途恒溫超聲提取器：北京泓祥隆生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：浙江臨海市精工真空設(shè)備廠(chǎng)；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密儀器有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋：上海比郎儀器制造有限公司；DT5-1式臺(tái)式離心機(jī)：北京北利離心機(jī)有限公司；FA2004B分析天平：上海天平儀器廠(chǎng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1超聲波輔助酶法提取苦瓜素工藝

鮮苦瓜洗凈，去籽，破碎成漿。取一定量的苦瓜漿置于超聲波提取器中，在超聲波功率，提取溫度，提取時(shí)間，料液比為一特定值條件下調(diào)節(jié)pH為5.0，分別加入一定用量的纖維素酶、果膠酶以及復(fù)合酶（纖維素酶：果膠酶=1∶1），進(jìn)行超聲波輔助酶法提取。將提取后的苦瓜漿過(guò)濾，上清液于65℃減壓濃縮至1/3體積后，加入4倍體積的濃度為85%的乙醇溶液進(jìn)行沉淀，靜置1h。將沉淀物離心、過(guò)濾，除去苦瓜素提取液中的多糖雜質(zhì)，得到苦瓜素粗提液。在苦瓜素粗提液中加入一定量的三氯乙酸，充分震蕩30min，靜置10min，出現(xiàn)白色沉淀，等到兩相界面穩(wěn)定后過(guò)濾，得到苦瓜素提取液，濃縮、干燥后得到苦瓜素晶體。

1.2.2苦瓜素提取單因素試驗(yàn)

稱(chēng)取20g的苦瓜漿，在超聲波功率為200W，提取時(shí)間為40min，溫度為50℃，料液比為1：8，復(fù)合酶用量為0.02%為基準(zhǔn)條件下，以苦瓜素提取率為考察指標(biāo)，改變其中一因素水平，保持其它因素水平不變，研究各單因素對(duì)苦瓜素提取率的影響。

1.2.3苦瓜素提取工藝參數(shù)優(yōu)化

按照1.2.1中介紹的提取苦瓜素的方法，結(jié)合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，選取對(duì)苦瓜素提取率影響較大的料液比、超聲波提取功率、提取時(shí)間、提取溫度這四個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以苦瓜素提取率為考察指標(biāo)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，正交試驗(yàn)因素水平表如表1所示。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4苦瓜素提取率的測(cè)定

苦瓜素提取率 （%）=（實(shí)際提取苦瓜素晶體的量/苦瓜素含量）×100%

其中苦瓜素含量按照參考文獻(xiàn)［5］中介紹的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel、SPSS13.0數(shù)據(jù)分析軟件分別對(duì)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差、方差分析。

2　試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1料液比對(duì)苦瓜素提取率的影響

圖1　料液比對(duì)苦瓜素提取率的影響

如圖1所示，當(dāng)料液比在1∶5-1∶8之間時(shí)，隨著料液比的增加，苦瓜素的提取率逐漸增加，這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著料液比的減小，溶質(zhì)在物料與溶劑中的濃度差越大，目標(biāo)物就越容易滲透出來(lái)［6］。

但當(dāng)料液比增加到1∶9之后，對(duì)苦瓜素的提取率影響不大并略呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槿苜|(zhì)提取率不會(huì)隨著料液比的減小而持續(xù)增大，此時(shí)繼續(xù)增加試劑反而造成溶劑資源的浪費(fèi)，考慮到要以低沉本、高提取率的原則，因此在實(shí)際試驗(yàn)過(guò)程中，適宜的料液比是1∶8-1∶10。

2.2超聲時(shí)間對(duì)苦瓜素提取率的影響

圖2　超聲時(shí)間對(duì)苦瓜素提取率的影響

如圖2所示，苦瓜素提取過(guò)程中，當(dāng)提取時(shí)間在20-60min之間時(shí)，隨著時(shí)間的增加，苦瓜素的提取率在逐漸增加；當(dāng)提取時(shí)間大于60min后，苦瓜素的提取率反而逐漸減小。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，超聲波對(duì)植物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞，從而導(dǎo)致提取率下降，故適宜的提取時(shí)間范圍為40-60min。

2.3超聲溫度對(duì)苦瓜素提取率的影響

如圖3所示，當(dāng)溫度在30-60℃之間時(shí)，隨著溫度的升高，苦瓜素的提取率逐漸提高；當(dāng)溫度大于60℃時(shí)，苦瓜素提取率呈下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槌暡ㄔ谡駝?dòng)過(guò)程中產(chǎn)生的熱能提高了介質(zhì)的環(huán)境溫度，而過(guò)高的環(huán)境溫度會(huì)導(dǎo)致苦瓜素變性，從而降低其提取率，故溫度設(shè)定為50-60℃比較合適。

圖3　超聲溫度對(duì)苦瓜素提取率的影響

2.4超聲波功率對(duì)苦瓜素提取率的影響

如圖4所示，超聲波功率在50W-200W范圍內(nèi)，隨著超聲波功率的增加，苦瓜素的提取率逐漸上升，溶劑分子對(duì)藥材基體的滲透和待提取成分的溶劑化被進(jìn)一步加速，從而使活性成分的提取量得以顯著提高［7］。此后繼續(xù)提高超聲波提取的功率，苦瓜素的提取率開(kāi)始下降，因此超聲波提取功率范圍在150W-250W之間比較合適。

2.5酶用量對(duì)苦瓜素提取率的影響

由圖5可以看出，隨著各種酶用量的增加，苦瓜素提取率逐漸增大。這是因?yàn)槔w維素酶可以將植物組織分解，從而減小傳質(zhì)阻力；果膠酶可將植物細(xì)胞壁間相連的果膠物質(zhì)進(jìn)行瓦解，使果肉中的苦瓜素成分釋放出來(lái)，從而提高苦瓜素提取率。然而，單獨(dú)使用纖維素酶或果膠酶去提取苦瓜素的效果并不理想，苦瓜素的提取率偏低。因此本文將纖維素酶和果膠酶按1∶1的比例制成復(fù)合酶制劑提取苦瓜素，結(jié)果顯示使用復(fù)合酶制劑提取苦瓜素的效果明顯優(yōu)于單一酶制劑。隨著復(fù)合酶制劑用量的增加，苦瓜素提取率亦呈上升趨勢(shì)，當(dāng)復(fù)合酶用量大于0.25%時(shí)，苦瓜素提取率趨于穩(wěn)定。因此，從經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，復(fù)合酶用量為0.25%比較適宜。

圖5　酶用量對(duì)苦瓜素提取率的影響

2.6正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)

正交試驗(yàn)優(yōu)化工藝參數(shù)見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表2　正交試驗(yàn)優(yōu)結(jié)果分析

表3　方差分析表

由表2中的極差分析可以看出超聲波輔助提取苦瓜素的最優(yōu)組合為A3B3C2D2，各因素影響的主次因素為D＞A＞C＞B，即超聲波功率＞料液比＞提取溫度＞提取時(shí)間。從表3中的方差分析可知D因素對(duì)苦瓜素提取率影響最為顯著，這與極差分析結(jié)果相同。但是因?yàn)锳3B3C2D2在正交試驗(yàn)表中并沒(méi)有出現(xiàn)，因此在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到苦瓜素的提取率為16.82%，優(yōu)于正交試驗(yàn)表2中苦瓜素最優(yōu)提取率，因此，超聲波輔助酶法提取苦瓜素的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶10、復(fù)合酶用量0.25%，提取時(shí)間60min、提取溫度55℃、超聲波功率200W。

3結(jié)　論

本文通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化得出超聲波輔助酶法提取苦瓜素的最優(yōu)工藝為料液比1：10、提取時(shí)間60min、提取溫度55℃、復(fù)合酶用量0.25%，超聲功率200W，在最優(yōu)條件下苦瓜素的提取率為16.82%。超聲波輔助酶法提取苦瓜素操作簡(jiǎn)便，提取時(shí)間短，提取率高，可為工業(yè)化生產(chǎn)苦瓜素提供一定的數(shù)據(jù)參考，關(guān)于苦瓜素的分離純化還需進(jìn)一步的研究探討。

［1］LUCAS E A，DUMANCAS G G，SMITH B J，et al.Health benefits of bitter melon（Momordica charantia）［J］.Bioactive Foods in Promoting Health，2010，35：525-529.

［2］王杰，張名位，劉興華，等.苦瓜的保健功能及其應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，24（4）：321-324.

［3］TPAUL M F，NG T B，F(xiàn)ONG W P，et al.New ribosomeinactivating proteins from seeds and fruits of the bitter gourd Momordica charantia［J］.The international Journal of BiochemistryCell Biology，1999，31：895-901.

［4］徐海洋，李靜.堿法提取苦瓜素工藝優(yōu)化［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（22）：13366-13368.

［5］齊文波，徐中平，徐譽(yù)泰，等.苦瓜素的分離純化與抗腫瘤活性的研究［J］.離子交換與吸附，1999，15（1）：59-63.

［6］潘利華，徐學(xué)玲，羅建平.水溶性大豆多糖的超聲波輔助酶法提取條件及抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2012，33（4）：77-81.

［7］程振玉，楊英杰，劉志剛.超聲波輔助酶法提取北五味子多糖工藝研究［J］.中國(guó)釀造，2014，33（3）：104-108.

責(zé)任編輯：胡德明

The Technology of Ultrasonic-assisted Enzyme Extraction of Elaterin

Wu Liping，Zhu Niu，Li Hui，Wang Dongsheng
（School of Life and Environmental Science，Huangshan University，Huangshan 245041，China）

The method of ultrasonic-assisted enzymatic extraction process is used to extract elaterin in M0mordica charantia L.，and the extraction technology is obtained through orthogonal test.The results show that the optimal ultrasonic-assisted enzymatic extraction condition is as follows：material/liquid ratio：1：10，amount of composite enzyme：0.25%，extraction time：50 min，extraction temperature：55℃，ultrasonic power：200W.Under the optimal condition，the extraction rate of elaterin is 16.82%.The method is highly efficient and environmental-friendly，which provides a theoretical basis for polysaccharide extraction of elaterin.

ultrasonic；enzymes；elaterin；extraction

TS209

A

1672-447X（2016）03-0040-004

2015-06-20

安徽省教育廳自然科學(xué)研究項(xiàng)目（KJHS2015B12）；黃山學(xué)院自然科學(xué)研究項(xiàng)目（2015xkj009）

吳麗萍（1982-），吉林長(zhǎng)春人，碩士，黃山學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院講師，研究方向?yàn)槭称沸虏牧现苽洹?/p>