王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業(yè)，劉學(xué)軍，任玉林，薛國(guó)強(qiáng)

（甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

膀胱及尿路上皮癌中CD44s的表達(dá)及臨床意義

王永翔，劉小榮，趙立明，馬弢業(yè)，劉學(xué)軍，任玉林，薛國(guó)強(qiáng)

（甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

目的 探討CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達(dá)，研究其對(duì)膀胱及尿路上皮癌的早期診斷價(jià)值。方法 收集膀胱及尿路上皮癌患者70例作為實(shí)驗(yàn)組，收集膀胱黏膜組織正常的患者20例作為對(duì)照組，從病理分期和臨床分期兩個(gè)方面，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)CD44s進(jìn)行定量分析。結(jié)果 CD44s蛋白在正常膀胱黏膜上皮無(wú)表達(dá)，拷貝數(shù)小于1× 102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽(yáng)性表達(dá)是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104copies/ml。CD44s的表達(dá)在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級(jí)間比較，有顯著性差異P〈0.05）。結(jié)論 CD44s與膀胱及尿路上皮癌的早期診斷具有相關(guān)性，可作為判斷膀胱及尿路上皮癌分化程度、臨床分期的參考指標(biāo)。

膀胱及尿路上皮癌；CD44s；早期診斷

膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移由腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為所決定，其中腫瘤細(xì)胞的黏附能力是重要方面。CD44最初被確認(rèn)為一種淋巴細(xì)胞歸巢受體和跨膜糖蛋白，一般表達(dá)在胚胎干細(xì)胞［1］，在淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的上皮細(xì)胞中都可檢測(cè)到，也可見于腫瘤細(xì)胞的表面［2］。大量的研究表明，CD44及其變異體在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，與乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、膽管癌、前列腺癌等多種腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移有密切聯(lián)系［3-4］，而與膀胱及尿路上皮癌的關(guān)系目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)從基因水平檢測(cè)CD44s在膀胱及尿路上皮癌中的表達(dá)，旨在探討CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后方面的關(guān)系，現(xiàn)介紹如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料

選取本院泌尿外科2010年1月—2014年1月行膀胱部分切除或全切除手術(shù)患者70例作為實(shí)驗(yàn)組，所有病例標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為膀胱及尿路上皮癌，其中男56例，女14例；年齡29～83歲，平均56歲；根據(jù)國(guó)際抗癌協(xié)會(huì)（UTCC）制訂的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Tis-a期13例，T1期24例，T2期20例，T3期9例，T4期4例；病理I級(jí)25例，Ⅱ級(jí)23例，Ⅲ級(jí)22例；初發(fā)組48例，復(fù)發(fā)組22例；單發(fā)組49例，多發(fā)組21例。正常膀胱黏膜組（對(duì)照組）20例，標(biāo)本取自經(jīng)恥骨上前列腺摘除術(shù)患者，經(jīng)病理證實(shí)為正常膀胱黏膜組織。

1.2儀器

API7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.3主要試劑

核酸提取液B、Taq酶系、CD44s PCR MIX、CD44s陽(yáng)性質(zhì)控品、CD44s陰性質(zhì)控品，均來(lái)自北京索奧生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.4實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.4.1DNA提取 取約50 mg膀胱黏膜組織轉(zhuǎn)移至1.5 ml干凈離心管中，加1ml生理鹽水混勻，用研磨器研制成勻漿，12000rpm離心5分鐘，棄上清液，沉淀加50 μl核酸提取液（DNA），充分混勻，100℃處理10分鐘，12 000 rpm離心5分鐘，取上清液4 μl 做PCR反應(yīng)。

1.4.2PCR擴(kuò)增從試劑盒中取出CD44s PCR MIX、Taq酶系，室溫融化并振蕩混勻后，10 000 rpm離心10秒。CD44s引物序列為Forward Primer：GGAGCAGCACTTCAGGAGGTTAC Reverse Primer GGAATGTGTCTTGGTCTCTGGTAGC，測(cè)試反應(yīng)體系配置為：CD44s PCR MIX 24 μl、Taq酶系2 μl。向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入26 μl反應(yīng)體系，向每管中加入處理后的樣品或CD44s陽(yáng)性質(zhì)控品（使用前用陰性質(zhì)控品梯度稀釋10倍、100倍、1 000倍，記為1×106copies/ml、1×105copies/ml、1×104copies/ml）和陰性質(zhì)控品4 μl，10 000 rpm瞬時(shí)離心3秒。將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品以及未知標(biāo)本，并設(shè)置反應(yīng)體系（30 μl）、樣品名稱，標(biāo)記熒光基團(tuán)種類（報(bào)告基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為TAMRA）和循環(huán)條件：95℃30秒，后95℃5秒，60℃30秒，40個(gè)循環(huán)。

1.4.3繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件 r值=0.99，CD44s陽(yáng)性表達(dá)值（Ct值）≤35，基因拷貝數(shù)為1×104copies/ml。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)，兩樣本率的比較行χ2檢驗(yàn)，P〈0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各待測(cè)反應(yīng)管曲線圖（見圖1～4）

圖1　TNM分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖2　WHO病理分級(jí)CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖3　臨床分期CD44s熒光定量PCR曲線圖

圖4　不同腫瘤數(shù)量CD44s熒光定量PCR曲線圖

2.2CD44s與膀胱及尿路上皮癌的關(guān)系

CD44s在正常膀胱黏膜上皮無(wú)表達(dá)，在70例膀胱及尿路上皮癌標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)31例，陽(yáng)性率為44.3%。CD44s與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展及復(fù)發(fā)之間的關(guān)系見表1。

表1　CD44s不同表達(dá)在不同TNM分期、不同WHO病理分級(jí)、腫瘤是否復(fù)發(fā)及不同腫瘤數(shù)量的人數(shù)分布（人）

結(jié)果顯示，CD44s與膀胱及尿路上皮癌TNM分期的關(guān)系：CD44s的表達(dá)在淺表性（Tis-a～T1）與浸潤(rùn)性（T2～T4）膀胱及尿路上皮癌中比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌WHO病理分級(jí)的關(guān)系：CD44s表達(dá)隨病理分級(jí)增加而升高，高分化膀胱及尿路上皮癌（I級(jí)）與低分化膀胱及尿路上皮癌（Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)）之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P〈0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌復(fù)發(fā)的關(guān)系：CD44s的表達(dá)在膀胱及尿路上皮癌是否復(fù)發(fā)的患者中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CD44s與膀胱及尿路上皮癌數(shù)量的關(guān)系：CD44s的表達(dá)在膀胱及尿路上皮癌單發(fā)和多發(fā)患者中比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

（1）腫瘤的生長(zhǎng)依賴于腫瘤細(xì)胞與宿主組織外基質(zhì)之間的相互作用。CD44屬于黏附分子家族中的成員，廣泛分布于細(xì)胞表面，是一種蛋白形式的細(xì)胞表面黏附因子，參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過(guò)程［5］。人類CD44基因位于11號(hào)染色體短臂（11p13）上，長(zhǎng)約92 kb，至少有21個(gè)外顯子，根據(jù)編碼蛋白的表達(dá)方式分為兩型：其中10個(gè)固定外顯子位于基因兩端，每端5個(gè)，轉(zhuǎn)錄時(shí)固定表達(dá)，其轉(zhuǎn)錄片段存在于所有CD44蛋白中，稱為標(biāo)準(zhǔn)型CD44基因（CD44s）；在固定的外顯子中間有6～15個(gè)外顯子僅表達(dá)于核RNA的剪接體中，轉(zhuǎn)錄時(shí)只存在于一定的CD44轉(zhuǎn)錄子中，表達(dá)不固定，稱為變異體CD44v基因，主要包括變異體CD44v1～10［6-7］。

（2）CD44s是存在于多種組織細(xì)胞的表面糖蛋白，而CD44v蛋白主要存在于發(fā)育成熟階段的組織器官細(xì)胞表面［8］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)基因水平、蛋白水平兩個(gè)方面檢測(cè)尿液中CD44，從而對(duì)膀胱腫瘤的分化、浸潤(rùn)、數(shù)量、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及預(yù)后做了大量的研究。目前關(guān)注較多的主要是 CD44s、CD44v2、CD44v6、CD44v8～10對(duì)膀胱腫瘤的診斷。CD44s及CD44v的異常表達(dá)與膀胱及尿路上皮癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的聯(lián)系，但目前仍未得出統(tǒng)一的結(jié)論，多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果認(rèn)為：CD44s表達(dá)缺失同時(shí)伴有CD44v表達(dá)增高與腫瘤分化程度較差、分期較晚有顯著關(guān)系［9］。Ross等研究結(jié)果認(rèn)為，CD44s在膀胱及尿路上皮癌中持續(xù)表達(dá)，但在分化差的浸潤(rùn)性癌中表達(dá)下降。Stevevn等［10］研究認(rèn)為，膀胱及尿路上皮癌組織和正常膀胱黏膜組織中都有CD44s和CD44v2蛋白的表達(dá)，結(jié)果CD44v2與腫瘤的分級(jí)、分期無(wú)關(guān)，認(rèn)為CD44v2不能作為診斷膀胱癌的指標(biāo)。

（3）本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，從基因水平檢測(cè)了人正常膀胱黏膜及膀胱和尿路上皮癌組織中CD44s的表達(dá)，探討了CD44s表達(dá)與膀胱尿路上皮癌TNM分期、WHO病理分級(jí)、腫瘤數(shù)量及復(fù)發(fā)的關(guān)系，結(jié)果CD44s在正常膀胱黏膜上皮無(wú)表達(dá)，拷貝數(shù)小于1×102copies/ml。在70例膀胱及尿路上皮癌中，CD44s陽(yáng)性表達(dá)是31例（44.3%），Ct值均小于35，基因拷貝數(shù)均大于1×104copies/ml。CD44s的表達(dá)在膀胱及尿路上皮癌TNM分期和WHO病理分級(jí)組間比較，有顯著性差異（P〈0.05），CD44s檢測(cè)有助于對(duì)膀胱及尿路上皮癌的早期診斷，具有臨床診斷價(jià)值［11］。

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1671-1246（2016）16-0133-03

蘭州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012-1-3）