周　宇　金　鑫　祁　磊　王玉斌　徐清妍　李秀娟　鄭瑪麗　鐘瑞生　林　媛

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【實驗研究】

石決明對氧化應(yīng)激所致白內(nèi)障的作用研究*

周宇1金鑫1祁磊2王玉斌2徐清妍2李秀娟2鄭瑪麗2鐘瑞生2林媛2

1.廈門大學醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部(廈門 361102) 2.福建省廈門市中醫(yī)院眼科(廈門 361009)

摘要：目的研究石決明提取物對體外培養(yǎng)的晶狀體氧化應(yīng)激性白內(nèi)障形成的作用及機制。方法離體培養(yǎng)小鼠晶狀體，應(yīng)用不同濃度的石決明提取物預(yù)孵育晶狀體24h后，加入1mm 過氧化氫，繼續(xù)培養(yǎng)3小時后恢復(fù)正常培養(yǎng)，72小時后觀察小鼠晶狀體混濁程度，測定晶狀體組織培養(yǎng)液中的乳酸脫氫酶(LDH)含量，晶狀體組織中還原型谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。結(jié)果石決明提取物在1～2 mg/ml濃度范圍內(nèi)減輕氧化應(yīng)激造成的晶狀體混濁，減少晶狀體LDH的釋放，提高組織內(nèi)GSH含量和SOD活力。結(jié)論石決明提取物可減輕氧化應(yīng)激白內(nèi)障的形成，其作用主要與石決明提取物提高內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：石決明；白內(nèi)障； 晶狀體；氧化應(yīng)激；小鼠

晶狀體是一個透明、富有彈性的無血管屈光組織，在視覺形成過程中發(fā)揮重要作用。白內(nèi)障即晶狀體混濁, 是我國乃至全世界致盲的最主要原因之一。盡管白內(nèi)障手術(shù)已日臻完善，但仍然存在手術(shù)費用較高，術(shù)后眼睛正常調(diào)節(jié)功能喪失，以及后發(fā)性白內(nèi)障高發(fā)等問題，給患者帶來諸多不便。特別隨著人口的老齡化, 這一難題更為突出, 因此尋找安全、有效、廉價的藥物治療白內(nèi)障具有重要的現(xiàn)實意義[1]。石決明是我國傳統(tǒng)動物類中藥，具有清肝明目的藥效，臨床上常用于治療目赤翳障、青盲雀目、視物昏花等眼科疾患[2]。研究報道大鼠灌胃給予含有石決明有效成分的復(fù)方制劑決明退障丸可延緩硒性白內(nèi)障的發(fā)生[3]。另有研究報道應(yīng)用石決明提取液滴眼可延緩半乳糖誘導(dǎo)的大鼠白內(nèi)障的發(fā)生[4]。以上研究結(jié)果提示石決明系統(tǒng)或局部給藥均可延緩白內(nèi)障的發(fā)生，但其作用機制尚不明確。最近一項研究報道石決明水提液可提高晶狀體上皮細胞的抗氧化酶活性，減輕脂質(zhì)過氧化損傷程度，保護晶狀體上皮細胞[5]，提示石決明提取液可能通過維持晶狀體氧化還原平衡，發(fā)揮抗白內(nèi)障形成作用。為進一步明確石決明提取物對晶狀體氧化應(yīng)激損傷的作用，我們擬采用晶狀體離體培養(yǎng)技術(shù)，應(yīng)用過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)晶狀體氧化應(yīng)激損傷建立白內(nèi)障模型，觀察不同濃度的石決明提取液對晶狀體氧化應(yīng)激損傷的作用，并測定晶狀體酶性和非酶性抗氧化指標的變化，探討石決明對晶狀體氧化損傷的抑制作用及機制。

1　材料和方法

1.1試驗藥物石決明由國家海洋局第三海洋研究所(廈門)提供。取石決明150 g用粉碎機粉碎后，過200目篩，加入4500ml(料液比=1:30)蒸餾水，90℃水浴冷凝回流2 h，重復(fù)提取兩次，合并提取液，經(jīng)抽濾濃縮至一定體積后，應(yīng)用冷凍干燥機進行凍干干燥，得粉末0.7 g，提取率為0.467%。臨用前用M199培養(yǎng)基配成相應(yīng)的濃度，經(jīng)0.22μM 微膜過濾備用。

1.2試驗動物昆明種小鼠60 只，雄性，體質(zhì)量20～22 g，SPF級，購自廈門大學實驗動物中心，許可證號 SYXK(閩)2008～0003。自然光照周期飼養(yǎng)，小鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng) 1 周后進行實驗。

1.3試劑M199組織培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國sigma 公司；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所。其余均為國產(chǎn)市售分析純產(chǎn)品。1.4儀器多功能酶標儀(Molecular Device, 美國)；組織勻漿機(IKA Labortechnik 公司，德國)；冷凍高速離心機(sigma 公司，美國)；小寶多功能粉碎機(永康市小寶電器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海愛朗儀器有限公司)；低溫冷卻循環(huán)泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；超凈工作臺(蘇州安泰)；CO2培養(yǎng)箱( Thermo Forma公司，美國)；顯微手術(shù)器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠，中國)；ZSA0850體式顯微鏡(重慶光學，中國)。

1.5方法

1.5.1DPPH法測定石決明的抗氧化作用將石決明提取物用70%乙醇配成不同濃度的溶液備用，DPPH用70%乙醇配成0.04mg/ml的溶液，吸取提取物溶液75μl于孔板中，加入DPPH溶液225μl作為樣品組；以70%乙醇代替DPPH溶液作為樣品背景組，以70%乙醇代替提取物溶液作為陰性對照組，置于30度培養(yǎng)箱中反應(yīng)30min,混勻后于室溫避光靜置30 min，在517nm處測定吸光度值，其中樣品孔為B, 樣品背景孔為C， 陰性對照孔為A。按以下公式計算提取物對DPPH自由基的清除率，平行測定3次。計算石決明不同提取物對DPPH自由基清除的IC50值。DPPH清除率(%)={1-(B-C)/A}*100%。

1.5.2晶狀體體外培養(yǎng)及實驗分組頸椎脫臼法處死小鼠，快速取出眼球，用75%乙醇沖洗1次，用生理鹽水沖洗兩次后，將眼球放入37℃ 預(yù)熱的M199培養(yǎng)液中，在無菌室超凈工作臺上，從后路小心剖開眼球，除去球壁和玻璃體，剝離懸韌帶，取出晶狀體，后極朝下置入含4ml 10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液的6孔培養(yǎng)板中，每孔1只晶狀體。于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，棄除混濁的晶狀體，選取透明晶狀體用于實驗。晶狀體隨機分為7組，每組8只，分別置入含有下列試劑的6孔培養(yǎng)板中。①空白對照組： M199 培養(yǎng)基;②石決明處理組：含 2mg/ml 石決明的M199 培養(yǎng)基；③維生素C處理組：含10mmol/ml維生素C的M199 培養(yǎng)基；④H2O2處理組：含 1 mmol/L H2O2的M199培養(yǎng)基；⑤石決明低劑量組：含 1 mmol/L H2O2和 0.1mg/ml 石決明的M199培養(yǎng)基；⑥石決明中劑量組：含 1 mmol/L H2O2和 1 mg/ml 石決明的M199培養(yǎng)基；⑦石決明高劑量組：含 1 mmol/L H2O2和 2 mg/ml 石決明的M199培養(yǎng)基。

各組晶狀體藥物預(yù)保護24 h，加入過氧化氫攻擊3 h，換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h。1.5.3晶狀體透明度的觀察及灰度值的測定將晶狀體置于白色背景垂直交叉的黑色線條上或黑色背景下，用帶拍照系統(tǒng)的體式顯微鏡拍照，前者用于晶狀體透明度的觀察，后者用ImageJ圖像分析軟件計算晶狀體灰度值。

1.5.4晶狀體培養(yǎng)上清液中LDH的測定取各組晶狀體組織的培養(yǎng)液，按照試劑盒操作說明，測定各組培養(yǎng)液中LDH值，反映晶狀體上皮細胞的損傷情況。

1.5.5晶狀體組織內(nèi)GSH含量和SOD活力的測定用圈匙從培養(yǎng)液中取出晶狀體，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，濾紙吸干稱重。放入盛有冰生理鹽水的玻璃勻漿器內(nèi)，按重量體積1:9進行組織勻漿，低溫 3000 r/min離心 15 min，取上清液，參照試劑盒說明測定晶狀體內(nèi)SOD活力值和GSH含量，反映晶狀體酶系和非酶系的抗氧化能力。

2　結(jié)果

2.1石決明提取物對DPPH自由基清除活性的影響 應(yīng)用DPPH法測定石決明提取物體外抗氧化能力，結(jié)果表明石決明提取物具有一定清除自由基的能力，在0.5～2mg/ml的濃度范圍內(nèi)劑量依賴性地清除DPPH自由基(圖1)。

圖1　石決明提取物對DPPH的清除率

2.2石決明提取物對晶狀體形態(tài)學的影響體外培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后，在體式顯微鏡下可見晶狀體皮質(zhì)和核均出現(xiàn)混濁，無法透過晶狀體觀察下面的網(wǎng)格線。0.1 mg/ml及2 mg/ml的石決明提取液劑量依賴性的改善晶狀體的混濁程度。單用2 mg/ml的石決明提取物對晶狀體的形態(tài)無明顯影響，表明高濃度的石決明提取液對晶狀體亦無明顯毒性。作為陽性對照藥維生素C(10 mM)也能明顯改善H2O2造成的晶狀體混濁(圖 2)。

圖2　石決明提取物對H2O2作用后體外培養(yǎng)晶狀體形態(tài)學的影響

2.3石決明提取物對晶狀體透明度的影響圖3a所示，離體培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后晶狀體的透明度明顯下降。應(yīng)用ImageJ圖像分析軟件計算晶狀體灰度值，結(jié)果表明模型組(單用H2O2組)晶狀體的灰度值與正常組相比增加了1.2倍。石決明提取物劑量依賴性地降低晶狀體的灰度值，提高晶狀體的透明度。其中2 mg/ml石決明提取物效果最好，與模型組相比，晶狀體的透明度顯著性增加，灰度值減少了24%(圖3 b)。作為陽性對照藥，10 mm維生素C也明顯減少晶狀體的灰度值，提高晶狀體的透明度，其作用與高濃度石決明提取物的作用接近。

2.4石決明提取物對晶狀體培養(yǎng)液中的LDH的影響圖4所示，離體培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后，模型組培養(yǎng)液中的LDH滲漏量是正常組的2.8倍，提示H2O2造成晶狀體上皮細胞損傷，細胞膜破裂，LDH滲漏增加。各濃度石決明提取物劑量依賴性地減少晶狀體培養(yǎng)液中LDH的滲漏，其中2 mg/ml的石決明效果最好，與模型組相比，LDH滲漏量減少28%，說明石決明可保護晶狀體上皮細胞，對抗氧化應(yīng)激損傷。單用石決明提取物對晶狀體上皮細胞無明顯影響。作為陽性對照藥，10mm維生素C也可減少LDH的滲漏。

2.5石決明提取物對晶狀體組織中GSH含量的影響離體培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后，晶狀體中GSH含量較正常對照組下降了60%， 提示氧化應(yīng)激造成晶狀體中內(nèi)源性抗氧化劑明顯減少。各濃度石決明提取物劑量依賴性地升高晶狀體中GSH含量，其中2 mg/ml石決明組GSH含量較模型組升高了41%。其升高GSH的幅度與陽性對照藥維生素C接近，后者升高GSH的含量與模型組相比為52%(圖5)。

2.6石決明提取物對晶狀體SOD活力的影響離體培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后，晶狀體中SOD活力與正常對照組相比下降了38%(圖6,P<0.01)，提示H2O2破壞了晶狀體中內(nèi)源性抗氧化物酶的活力。各濃度石決明提取物劑量依賴性地升高晶狀體中SOD活力，其中2 mg/ml的石決明與模型組相比，晶狀體中SOD的活力升高了35%，接近陽性對照藥維生素C(圖6)。

3　討論

本研究首次利用晶狀體離體培養(yǎng)技術(shù)，觀察不同濃度的石決明提取物對H2O2誘導(dǎo)的小鼠晶狀體氧化應(yīng)激損傷的保護作用并分析其作用機制。晶狀體的氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)白內(nèi)障特別是老年性白內(nèi)障的重要因素。晶狀體組織結(jié)構(gòu)中沒有血管，其能量主要由葡萄糖的無氧酵解供給，因此晶狀體在代謝過程中不可避免的產(chǎn)生大量的氧自由基如超氧陰離子，羥自由基和H2O2，對晶狀體中的膜與蛋白造成氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而不同程度地影響晶狀體透明度。但同時晶狀體本身亦存在完善的抗氧化體系，可以清除不斷產(chǎn)生的過氧化物和自由基，保持透明度。但在某些情況下, 如體內(nèi)氧化物質(zhì)產(chǎn)生過多或晶狀體清除氧自由基的能力下降, 晶狀體則發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，形成白內(nèi)障。臨床研究亦發(fā)現(xiàn)在正常及白內(nèi)障眼的晶狀體及房水中均存在一定量的H2O2，且白內(nèi)障患者眼內(nèi)H2O2的含量較正常人明顯增高[6]。因此具有氧自由基清除能力或提高晶狀體內(nèi)源性抗氧化能力的物質(zhì)將有助于維持晶狀體的透明性，延緩白內(nèi)障的發(fā)生。我們的研究結(jié)果表明離體培養(yǎng)的小鼠晶狀體經(jīng)1 mm H2O2攻擊3 h，恢復(fù)正常培養(yǎng)72 h后，模型組晶狀體全部混濁即形成了白內(nèi)障，而石決明提取物組晶狀體僅部分出現(xiàn)霧樣混濁,，無1例發(fā)生白內(nèi)障。石決明提取物劑量依賴性地降低晶狀體的渾濁度，其中2 mg/ml濃度的石決明提取物抑制氧化應(yīng)激性白內(nèi)障的作用甚至與陽性對照藥維生素C相當。以上研究結(jié)果進一步明確了石決明提取物抗氧化應(yīng)激性白內(nèi)障形成的作用。

圖3　石決明提取物對H2O2作用后體外培養(yǎng)晶狀體透明度的影響

圖4　石決明提取物對H2O2作用后體外培養(yǎng)晶狀體培養(yǎng)液中LDH滲漏的影響

圖5　石決明提取物對H2O2作用后體外培養(yǎng)晶狀體GSH含量的影響

圖6　石決明提取物對H2O2作用后體外培養(yǎng)晶狀體SOD活力的影響

晶狀體上皮細胞是晶狀體代謝最活躍的部位, 是整個晶狀體代謝的關(guān)鍵, 其形態(tài)與功能的正常與否直接影響晶狀體的透明度。氧化應(yīng)激首先損害晶狀體上皮細胞，白內(nèi)障的形成也和晶狀體上皮細胞的損害密切相關(guān)。LDH是細胞內(nèi)的標志酶，正常狀態(tài)下細胞內(nèi)漏出量很少。但細胞受損后，由于細胞膜通透性增加，LDH由細胞滲漏至培養(yǎng)液中的量明顯增多，因此通過測定細胞培養(yǎng)液LDH 滲漏量可客觀的衡量細胞受損的程度。我們的研究結(jié)果表明1 mm的H2O2可造成晶狀體培養(yǎng)液中LDH滲漏明顯升高，說明H2O2可損傷晶狀體上皮細胞，而石決明提取液濃度依賴性地減少LDH的滲透，提示石決明提取液可能有助于對抗晶狀體上皮細胞的氧化應(yīng)激損傷。這一研究結(jié)果與研究報道石決明提取液可對抗H2O2造成的體外培養(yǎng)晶狀體上皮細胞氧化應(yīng)激損傷[5]是一致的。

正常人晶狀體中同時存在非酶性和酶性內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)[7]。非酶性抗氧化系統(tǒng)主要指一些低分子量抗氧化劑如GSH。GSH是晶狀體中含量較多的內(nèi)源性抗氧化活性物質(zhì)，可以清除超氧陰離子、H2O2等氧自由基, 并維持晶狀體蛋白的巰基呈還原狀態(tài), 防止蛋白變性, 對維持晶狀體的透明度起重要作用。幾乎在所有類型白內(nèi)障晶狀體內(nèi)，GSH含量均下降，且隨晶狀體混濁加重而劇減，因此認為GSH缺乏是白內(nèi)障的成因之一。抗氧化酶系統(tǒng)如SOD，是晶狀體維持氧化還原平衡的另一重要系統(tǒng)。SOD有助于清除超氧陰離子自由基(O2-.)，保護細胞免受氧化應(yīng)激損傷，在維持晶狀體的氧化還原平衡中起重要作用。本研究結(jié)果也證明H2O2可損害晶狀體的抗氧化體系，減少GSH含量和降低SOD活力，從而促進白內(nèi)障的發(fā)生。石決明提取物在升高晶狀體內(nèi)GSH含量和SOD活力的同時，也改善晶狀體的透明度，從而延緩白內(nèi)障的進展。

石決明來源于軟體動物門鮑科動物的貝殼，可分為角質(zhì)層、棱柱層和珍珠層。石決明主要化學成分90%以上為碳酸鈣，有機組分僅占3.67%，且主要位于珍珠層，但這少量的的珍珠層可能是石決明發(fā)揮抗白內(nèi)障作用的重要成分。研究報道珍珠層中含有鎂、鐵、鋅、鍶、硒、銅、碘等無機微量元素，均為人體中缺乏而又很難補充的微量元素，其中鋅是維持晶狀體內(nèi)糖無氧酵解酶系中不可缺少的微量元素；石決明的珍珠層經(jīng)鹽水解可得到16種氨基酸，能增強透明質(zhì)酸、硫酸軟骨索等的合成，從而保護眼睛晶狀體[8]。此外，石決明中的抗氧化成分亦是其發(fā)揮抗氧化應(yīng)激性白內(nèi)障形成的重要因素。研究報道石決明珍珠層與珍珠的成分非常相似，而后者水提液具有很高的活性氧自由基清除活性，并能延緩白內(nèi)障的發(fā)生[9]。本研究應(yīng)用DPPH法測定石決明提取物的體外抗氧化能力，結(jié)果表明石決明提取物在體外具有一定的直接清除氧自由基的能力，但明顯弱于維生素C。但在離體培養(yǎng)的晶狀體氧化應(yīng)激性白內(nèi)障模型上，本研究發(fā)現(xiàn)2 mg/ml的石決明提取液增加晶狀體GSH含量和提高SOD活力的作用與10mm的維生素C相當，并且其減輕氧化應(yīng)激性白內(nèi)障形成的作用也與維生素C相當。因此本研究結(jié)果提示石決明提取物提高晶狀體抗氧化能力可能是其對抗氧化應(yīng)激性白內(nèi)障形成的主要機制。

總之，本研究結(jié)果表明石決明提取液可明顯減少H2O2誘導(dǎo)的白內(nèi)障形成，其作用機制與其保護晶狀體SOD活性，維持GSH含量，減少晶狀體上皮細胞的損傷有關(guān)。石決明作為一種天然藥物, 來源廣泛，且無明顯不良反應(yīng)，因此石決明對晶狀體的保護作用意義重大，若將其開發(fā)為系統(tǒng)性或局部性預(yù)防及治療白內(nèi)障的天然藥物，將具有廣闊的應(yīng)用前景。

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*基金項目：2012年福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研專項課題(No.WST201210)；2013年福建省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研專項課題(No.wzhw201302)；2014年廈門市科技局科技惠民項目課題(No.3502Z20144030)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.05.021

文章編號：1003-8914(2016)-05-0650-06

收稿日期：(本文校對：林媛2015-06-23)

Experimental Study of the Abalone Shell on Cataract induced by Oxidative Stress

ZHOU Yu1JIN Xin1QI Lei2WANG Yubin2XU Qingyan2ZHENG Mali2ZHONG Ruisheng2LIN Yuan2

(1. Department of Pharmacology, Medical School, Xiamen University, Fujian, Xiamen 361102, China;2. Department of Ophthalmology, Xiamen Hospital of TCM, Fujian, Xiamen 361009, China)

Abstract：ObjectiveTo study the effect of the abalone shell extract on oxidative stress induced cataract formation and its mechanism in cultured mouse lens in vitro. MethodsThe cultured mouse lens were pretreated with the abalone shell extract in different concentrations for 24 hours, and then 1mm hydrogen peroxide was added and continued incubating for 3 hours, and they were changed to normal culture media. After 72 hours, the opacity of each lens was observed under an anatomical microscope, the content of lactate dehydrogenase (LDH) leakages, the content of the reduced glutathione (GSH) and activity of superoxide dismutase (SOD) in lens tissue were assayed. ResultsAbalone shell extract in the concentration range of 1～2 mg / ml reduced the lens opacity caused by oxidative stress, alleviated the release of LDH, and increased GSH content and SOD activity in cultured lens. ConclusionAbalone shell extract can alleviate the oxidative stress induced cataract formation, and this effect is mainly related to its improvement of the endogenous antioxidant system in lens.

Key words：Abalone shell; Cataract; Lens; Organ culture, Oxidative stress; Mouse