范曄　于樂成

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缺氧誘導(dǎo)因子在肝病和肝細(xì)胞癌發(fā)病及治療中的作用：現(xiàn)狀及展望

范曄于樂成

缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIFs)是一種轉(zhuǎn)錄因子，能活化調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、血管生成、增殖和遷移的不同信號通路，使細(xì)胞能夠?qū)Φ脱趸蛉毖醐h(huán)境做出應(yīng)答。HIFs受到氧依賴性和非氧依賴性信號的調(diào)節(jié)，包括線粒體功能障礙、活性氧基團(tuán)(reactive oxygen species，ROS)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticular stress，ERS)和病毒感染等。已發(fā)現(xiàn)HIFs在多種肝病的發(fā)病機(jī)制中起作用。本文論述了HIFs對肝細(xì)胞生物學(xué)和炎癥應(yīng)答的影響，以及靶向于HIFs的治療策略對多種肝病的潛在治療價值[1]。

一、肝臟的組織結(jié)構(gòu)和生理性氧梯度

氧是所有活細(xì)胞存活所必需的。氧通過脈管系統(tǒng)運(yùn)行周身，受代謝需求以及組織或器官功能狀態(tài)的調(diào)節(jié)。肝臟具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能，從而影響其生理學(xué)和氧平衡：通過肝動脈接受氧含量高的血液，而肝門靜脈中的血液氧含量很低。流向肝小葉中央靜脈的定向血流建立了一種生理性氧梯度，導(dǎo)致氧分壓(PaO2)在門靜脈周圍區(qū)域是60～65 mmHg(8%)，在肝實(shí)質(zhì)靜脈周圍區(qū)域則為30～35 mmHg(4%)。這種氧梯度與肝實(shí)質(zhì)各區(qū)帶的功能差異和結(jié)構(gòu)異質(zhì)性密切相關(guān)(圖1)?！把鹾空?normoxia)”和“缺氧(hypoxia)”等相關(guān)術(shù)語的定義取決于相應(yīng)器官所暴露的正常氧張力。必須指出的是，盡管肝內(nèi)存在不同的氧張力，但在正常健康肝臟中并未觀察到缺氧反應(yīng)。而在病毒性肝炎、代謝紊亂、脂肪性肝炎、炎癥和癌變期間發(fā)生的適度的氧張力變化，足以誘發(fā)缺氧應(yīng)答以穩(wěn)定HIFs。

A：肝小葉(蘇木精和伊紅染色)被分為三個區(qū)帶，從匯管區(qū)延伸至小葉中央靜脈。B：血液經(jīng)肝動脈和門靜脈進(jìn)入肝臟(1帶/門靜脈周圍區(qū))，通過肝竇流經(jīng)肝小葉，血液含有豐富的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)；當(dāng)血液到達(dá)3帶(中央靜脈周圍區(qū))，氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)被消耗。1帶：門脈周圍區(qū)。2帶：中間區(qū)。3帶：中央靜脈周圍區(qū)。LESCs：肝竇內(nèi)皮細(xì)胞。HSCs：肝臟星狀細(xì)胞。

圖1肝臟的組織結(jié)構(gòu)和氧梯度

二、HIFs的調(diào)節(jié)

(一)氧依賴性調(diào)節(jié)細(xì)胞通過協(xié)調(diào)性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來適應(yīng)低氧，這種轉(zhuǎn)錄受HIFs的調(diào)控。HIFs屬于“周期節(jié)律性蛋白-芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-專一蛋白” (period circadian protein-aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-single minded protein，PAS)家族。HIFs可與靶基因中的缺氧應(yīng)答元件(hypoxia responsive elements，HREs)相結(jié)合，從而調(diào)控大量信號事件，導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄增加或減少。

有三種HIF轉(zhuǎn)錄因子，即HIF-1、HIF-2和HIF-3，是由α和β亞基組成的異質(zhì)性二聚體。α亞基受氧誘導(dǎo)性蛋白降解反應(yīng)的調(diào)控，而β亞基是組成性表達(dá)。雖然HIF-α亞基在缺氧時是穩(wěn)定的，但在正常氧張力下，HIF-α可被含有脯氨酰羥化酶功能域的蛋白質(zhì)(prolyl hydroxylase domain-containing proteins，PHD1-3)對其脯氨酰殘基進(jìn)行羥基化，從而迅速被降解。刪除肝臟特異性PHD2，可使HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，而刪除PHD3則可穩(wěn)定HIF-2α，這顯示了HIF調(diào)控的差異性。羥脯氨?；鶜埢籿on Hippel-Lindau(pVHL)E3泛素連接酶識別， 使得HIF-α亞基多聚泛素化，成為蛋白酶體降解的靶點(diǎn)(圖2)。缺氧時PHD活性降低，導(dǎo)致HIF-α亞基穩(wěn)定表達(dá)，并通過其N末端和C末端的反式激活域與調(diào)控元件結(jié)合。HIFs和CREB結(jié)合蛋白(CBP)發(fā)生關(guān)聯(lián)，形成轉(zhuǎn)錄激活因子復(fù)合物。隨著低氧時間延長，正如在病理狀態(tài)下所觀察到的那樣，HIF-1α依賴性反饋回路增加PHD的表達(dá)，導(dǎo)致HIF-1α羥基化再激活和降解。因此，HIF-1α的表達(dá)可代表對低PaO2的急性應(yīng)答，而HIF-2α的水平可隨缺氧時間延長而增加，從而在慢性缺氧中發(fā)揮某種作用。

另一種氧敏感性羥化酶，即因子抑制性HIF(factor inhibiting HIF，F(xiàn)IH)也很重要，可調(diào)控HIF-1α的表達(dá)。FIH可羥化HIF-1α的C末端反式激活區(qū)的一個天冬酰胺殘基(在人類為N803)，但并不羥化HIF-2α，從而抑制異二聚體HIF-1α結(jié)合至其轉(zhuǎn)錄共激活因子p300。據(jù)報道，雖然PHDs對氧的親和力較低(體外表觀Km為230-250 μM，略高于21% O2)，而FIH的Km為90 μM(8%)。這高度提示可被缺氧反式激活的基因具有其識別標(biāo)志，例如FIH可限制HIF-1α的C末端反式激活區(qū)而不是N末端區(qū)的活性。通過這種方式，細(xì)胞可呈現(xiàn)出雙相的HIF-1α依賴性轉(zhuǎn)錄特征：中度缺氧時為PHD滅活依賴性型，更嚴(yán)重缺氧時為PHD 和FIH滅活依賴性型。

(二)氧非依賴性調(diào)節(jié)多種氧非依賴性信號事件和細(xì)胞應(yīng)激可使HIFα亞基在有氧情況下仍能保持穩(wěn)定，這種表型稱為“假性缺氧”(圖3)。細(xì)胞表面受體，例如G蛋白偶聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶，可促進(jìn)HIF-1α mRNA的翻譯和反式激活活性。在磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路上，某種生長因子(例如胰島素樣生長因子1)和同源受體相結(jié)合，激活PI3K，進(jìn)而刺激下游的絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt和雷帕霉素的機(jī)械靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)，從而在微環(huán)境和HIF信號之間提供一種聯(lián)系，因?yàn)閙TOR的活性取決于局部環(huán)境中氨基酸的濃度。另外，生長因子還能激活EPK和p70S6K1，后者是HIF-1α mRNA翻譯所必需的重要因子。除了激活p70S6K1，EPK還能刺激MAPK相互作用蛋白，通過抑制4E結(jié)合蛋白(4E-BP)而激活翻譯起始因子elF4E和mTOR。

圖2氧依賴性HIF信號

在正常氧張力下(氧含量正常)，細(xì)胞的氧感受器脯氨酰羥化酶(PHD1-3)和因子抑制性HIF(FIH)對HIFα亞基的特異性殘基進(jìn)行羥基化(PHDs使HIF-1α和2α羥基化，F(xiàn)IH使HIF-1α羥基化)。羥基化的HIFα被von Hippel-Lindau(pVHL)E3泛素連接酶識別并被泛素化，聚泛素化的HIFα導(dǎo)致蛋白酶體的降解。在低氧下(缺氧)條件下，PHD和FIH活性被抑制，導(dǎo)致穩(wěn)定的HIFα表達(dá)和發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并在細(xì)胞核中與β亞基形成二聚體。在Cbp/p300等共激活分子的協(xié)助下，HIF復(fù)合物發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，結(jié)合至被定義為缺氧應(yīng)答元件(HREs)的特異DNA序列，從而激活腫瘤轉(zhuǎn)移、細(xì)胞存活、新陳代謝和免疫應(yīng)答等眾多信號事件中的基因轉(zhuǎn)錄。HIFα信號通路具有自我調(diào)控性，細(xì)胞核中的HIF-1α促進(jìn)PHD的表達(dá)，產(chǎn)生負(fù)反饋回路，從而確保此通路不被組成性活化。

圖3氧非依賴性HIF信號

在假性缺氧狀態(tài)下，脯氨酰羥化酶(PHD)和因子抑制性HIF(FIH)功能喪失，導(dǎo)致不管氧張力如何，缺氧誘導(dǎo)因子α(HIFα)都能組成性表達(dá)。這種狀況可以是病毒感染或異常激酶信號的結(jié)果。例如：生長因子和同源受體相結(jié)合后，激活MAPK通路，穩(wěn)定HIFα。類似地，線粒體功能障礙能促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，可作用于MARK從而穩(wěn)定HIFα。乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)可通過尚不清楚的機(jī)制使HIF-1α在氧含量正常的情況下也能保持穩(wěn)定。

營養(yǎng)可供性的改變能直接影響HIFα蛋白的水平。鑒于PHDs和FIH的活性都有賴一種酮戊二酸，因此凡能導(dǎo)致低水平2-氧代酸的情況均可能增加HIF的轉(zhuǎn)錄活性。最后，線粒體功能障礙可借助來自電子傳遞鏈的ROS滅活PHD的活性，從而穩(wěn)定HIFα亞基。炎癥時ROS水平可通過多種機(jī)制得以增加，包括NADPH氧化酶活性和作為對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)應(yīng)答的下游鈣的釋放。

HIF系統(tǒng)在體內(nèi)受許多互聯(lián)信號機(jī)制的調(diào)控。在可影響肝臟并穩(wěn)定HIFs的病理?xiàng)l件下，潛在的機(jī)制可能會隨著時間而改變，導(dǎo)致HIF-1α的表達(dá)延長。例如，在缺血期間，血流量的急性減少可使HIF-1保持穩(wěn)定。但一旦再灌注，大量涌入的ROS就會激活PHDs，導(dǎo)致氧非依賴性HIF的表達(dá)。可能的情況是，在肝臟生理氧梯度的較低端(即～4% O2)，組織PaO2或非缺氧通路的較小改變即對HIFs的調(diào)控產(chǎn)生顯著的影響。

三、HIFs在不同肝病發(fā)病機(jī)制中的作用及潛在治療價值

(一)缺血-再灌注性肝損傷缺血-再灌注(I/R)介導(dǎo)的肝損傷發(fā)生在肝臟切除和移植前的器官保存階段，是移植肝功能異常的一個主要因素。缺血期間，氧和營養(yǎng)物質(zhì)的損失導(dǎo)致ATP水平急劇下降，引起膜功能和代謝異常。但在血液供應(yīng)恢復(fù)(再灌注)后，由ROS介導(dǎo)的細(xì)胞蛋白和脂質(zhì)的氧化所引起的細(xì)胞損傷，即使未導(dǎo)致細(xì)胞死亡，也將引起明顯的細(xì)胞功能受損。雖然用完全缺氧的液體灌注肝臟可導(dǎo)致整個肝小葉均勻缺血，但血流減少引起的缺血在肝臟中央周圍區(qū)域是不同的，提示存在缺血性代謝應(yīng)答，而肝臟其余部分則不受影響。大量的器官研究顯示，HIFs在保護(hù)肝臟免受I/R損傷方面具有重要作用。HIF的活化處于許多已得到很好描述的保護(hù)性通路的下游，包括腺苷、一氧化氮和AKT信號等，其活性支持氧非依賴性ATP的產(chǎn)生以及“細(xì)胞保護(hù)系統(tǒng)”的上調(diào)，例如抗氧化劑和抗細(xì)胞凋亡蛋白，從而允許在缺血期間和缺血后細(xì)胞能夠生存。

(二)脂肪性肝病脂肪性肝病或肝脂肪變性，是肝細(xì)胞胞漿中大泡性或微泡性脂滴的過度累積，是促進(jìn)肥胖、2型糖尿病及心血管疾病形成的一個主要健康問題。臨床上分為酒精性脂肪性肝病(AFLD)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，兩者均可導(dǎo)致肝纖維化、肝硬化和肝癌。有報道表明連續(xù)給大鼠喂飼乙醇飲食，可導(dǎo)致肝臟缺氧，雖然HIF-1對酒精性肝損傷的直接作用尚不清楚。應(yīng)用大鼠肝細(xì)胞進(jìn)行研究表明，小靜脈周圍細(xì)胞脂質(zhì)新生增強(qiáng)，加上進(jìn)入細(xì)胞的外源性脂肪酸和極低密度脂蛋白酯化增加，都間接支持低氧能夠調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)代謝。文獻(xiàn)報道支持HIFs具有調(diào)節(jié)肝臟脂肪生成的作用，近來的研究致力于闡明HIF-1和2α對肝臟脂肪形成的相對促進(jìn)作用。

關(guān)于HIF-1α在脂肪性肝炎中的作用，相關(guān)報道是相互矛盾的。給肝細(xì)胞特異性Hif-1α敲除的小鼠喂飼乙醇飲食，可通過抑制HIF-1α的靶基因，亦即分化的胚胎軟骨細(xì)胞基因1(differentiated embryo chondrocyte gene 1，Dec1)，而致使甘油三酯和脂質(zhì)累積。Dec1超表達(dá)可逆轉(zhuǎn)酒精對肝臟生物學(xué)的不良影響，這支持受HIF-1α調(diào)控的基因在保護(hù)小鼠不發(fā)生AFLD方面具有正向調(diào)控作用。但Nath等報道，激活HIF-1α可誘導(dǎo)喂飼乙醇的cre-lox小鼠模型發(fā)生肝細(xì)胞脂肪變性和甘油三脂水平增加，而刪除HIF-1α可阻止乙醇誘導(dǎo)的脂質(zhì)堆積。這些研究結(jié)論不一致性的原因尚不清楚，可能與所使用的小鼠模型不同有關(guān)；但最近另一項(xiàng)研究的結(jié)論與Nath等的發(fā)現(xiàn)相一致，即HIF-2敲除的成年小鼠可發(fā)生肝脂肪變性。相反，Kim等報道，激活小鼠肝臟中的HIF-1α或HIF-2α對脂質(zhì)堆積的影響甚微。激活HIF-1α和HIF-2α均可促進(jìn)大泡性脂質(zhì)堆積，但這種表型與以脂肪變性為特征的人類肝病之間的關(guān)系還有待闡明。

Vhl/Hif1α基因失活可導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生HIF-2α特異性應(yīng)答，誘導(dǎo)脂肪性肝炎伴脂肪酸β氧化受損和肝細(xì)胞中脂滴增加。而HIF2α失活可減輕脂肪性肝炎。這些數(shù)據(jù)突出說明HIF-2α具有解除肝脂質(zhì)平衡的潛在作用。破壞小鼠的Vhl可導(dǎo)致HIF-2α依賴性肝臟脂質(zhì)堆積的增加，基因組分析研究顯示與脂肪酸合成及攝取相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄增加。這些研究突出顯示HIF-2α可作為脂肪性肝炎的潛在治療靶點(diǎn)。然而，肝臟特異性Phd3敲除的小鼠可穩(wěn)定表達(dá)HIF-2α，其胰島素信號得以改善，這使得HIF-2α對肝臟脂肪生成的干擾作用顯得撲朔迷離。這些觀察結(jié)果得到了Wei等的支持，他們發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟中HIF-2α的表達(dá)和通過誘導(dǎo)胰島素受體底物2而增加的肝臟胰島素敏感性之間存在關(guān)聯(lián)。他們還發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抑制劑治療后，有糖尿病小鼠和無糖尿病小鼠的糖耐量及胰島素信號均得以改善。VEGF的抑制可限制肝竇血管化，誘導(dǎo)局部缺氧，導(dǎo)致HIF-2α表達(dá)。

上述數(shù)據(jù)突出顯示了HIF-2α在肝臟中的多重作用，其在肝臟中的表達(dá)既能改善糖尿病，又能加重脂質(zhì)代謝紊亂。下一步研究需要闡明HIFs賴以調(diào)節(jié)肝臟脂質(zhì)平衡的機(jī)制。

(三)肝臟炎癥各種病因引起的慢性肝炎以免疫細(xì)胞侵潤而致肝細(xì)胞損傷為特征，但肝實(shí)質(zhì)中不同的氧水平對免疫細(xì)胞功能的影響尚不清楚。已知炎癥可誘導(dǎo)代謝供需比值的偏移而導(dǎo)致局部組織缺氧，誘導(dǎo)細(xì)胞類別依賴性HIF轉(zhuǎn)錄活性，從而調(diào)節(jié)促炎和抗炎應(yīng)答。新近研究表明HIF-1α可上調(diào)TLR4在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，提示炎癥部位的缺氧應(yīng)激可增強(qiáng)對細(xì)菌性病原體的固有細(xì)胞應(yīng)答。在缺氧的巨噬細(xì)胞，IFN-γ、MHC-II和可促進(jìn)抗原遞呈能力及免疫突觸形成以提高T細(xì)胞因子產(chǎn)生的共刺激分子均是增加的。應(yīng)用髓源特異性Hif1敲除的小鼠進(jìn)行研究顯示，HIF-1在促進(jìn)樹突狀細(xì)胞合成干擾素和活化T細(xì)胞方面具有重要作用。Larbi等報道，改變了的CD3/CD28依賴性T細(xì)胞增殖以及低氧張力下呼吸途徑向糖酵解的轉(zhuǎn)換，提示活化閾值、增殖和對細(xì)胞凋亡的敏感性在不同的缺氧水平是不同的。新近兩份報道突出顯示，在人和鼠單個核細(xì)胞，缺氧對誘導(dǎo)FOXP3表達(dá)具有正調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)對效應(yīng)細(xì)胞增殖的抑制頻率和能力均增加。該結(jié)果與下述報道是一致的，亦即在慢性HCV和HBV感染者的肝臟中，發(fā)現(xiàn)能夠產(chǎn)生白細(xì)胞介素-8(IL-8)的FOXP3+CD4+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的富集?？傊?，這些研究突出顯示了HIFs在聯(lián)接固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)過程中的多重作用，并展示了代謝信號的缺氧依賴性改變?nèi)绾握T導(dǎo)抗炎程序，這為慢性肝炎的治療提供了新的契機(jī)。

肝纖維化以I型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白在肝實(shí)質(zhì)中的過度沉積為特征，是對持續(xù)或反復(fù)發(fā)生的損傷的愈合反應(yīng)。肝實(shí)質(zhì)血管的改變可促進(jìn)該區(qū)域缺氧。需要注意的是，纖維化模式隨潛在疾病的不同而異。HIF-1α的表達(dá)能激活肝星狀細(xì)胞(HSCs)和成纖維細(xì)胞分化為成肌纖維細(xì)胞，成肌纖維細(xì)增殖并遷移至受損區(qū)域分泌ECM。結(jié)扎膽管制作的肝纖維化小鼠模型在術(shù)后3d即有HIF-1α表達(dá)增加，而Hif1α缺失的小鼠在膽管結(jié)扎后，肝纖維化介質(zhì)的產(chǎn)生顯著減少。

肝損傷發(fā)生后，巨噬細(xì)胞募集到炎癥區(qū)域，分泌轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和血小板衍生的生長因子(PDGF)，激活HSCs并促進(jìn)肝纖維化形成。在原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)和原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)患者肝活檢標(biāo)本的巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和肝細(xì)胞中可檢測到核HIF-1α?？傊@些數(shù)據(jù)支持巨噬細(xì)胞可表達(dá)HIFs并在肝纖維化的發(fā)生進(jìn)展過程中具有某種潛在作用，但尚不清楚在肝纖維化背景下巨噬細(xì)胞是如何獲得缺氧表型。應(yīng)用經(jīng)過遺傳學(xué)處理的小鼠研究顯示，破壞肝臟特異性Vhl后，可通過HIF-2α依賴性方式增強(qiáng)促肝纖維化基因的表達(dá)，這也得到全基因組微列陣分析的證實(shí)；這些發(fā)現(xiàn)提示HIF-2α在肝纖維化的形成過程中具有潛在的正向作用。相反，在HIF-2α特異性缺失的小鼠，促纖維化基因的表達(dá)顯著減少。

(四)病毒性肝炎HBV和HCV均能穩(wěn)定HIF-1α并促進(jìn)假性缺氧狀態(tài)的形成。這兩種病毒感染均可導(dǎo)致嚴(yán)重的進(jìn)展性肝病，包括脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化和肝癌。HBx蛋白是具有轉(zhuǎn)錄活性的多功能蛋白，可與核轉(zhuǎn)錄因子相互作用，并對細(xì)胞漿內(nèi)的RAS/RAF/MAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等進(jìn)行調(diào)制。表達(dá)HBx的轉(zhuǎn)基因小鼠可發(fā)生腺瘤和惡性腫瘤。體外研究顯示HBV的致瘤性由HIF-1α介導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞的侵犯性和增殖性均增強(qiáng)。HBx基因中的常見突變可增強(qiáng)HIF-1α的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性，提示不同的HBV基因型可預(yù)測肝癌的發(fā)病機(jī)制。雖然越來越多的證據(jù)表明HBx能穩(wěn)定HIF-1α，但大部分報道均是采用異位蛋白表達(dá)、而不是采用病毒感染的方式進(jìn)行研究，這也反映了全長HBV基因組在體外對靶細(xì)胞的感染能力有限。但不管如何，在感染細(xì)胞背景研究HBx的活性是一種全球性嘗試，突出表明研發(fā)能夠支撐HBV復(fù)制的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)是非常必要的。

HCV相關(guān)研究展現(xiàn)了一種病毒誘導(dǎo)的假性缺氧應(yīng)答，在氧分壓正常時有HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)。缺氧可促進(jìn)HCV復(fù)制，而抑制HIF-1α活性可減弱HCV復(fù)制。目前尚不清楚HIF-1α在HCV生命周期中的作用。但可以假設(shè)，HIF依賴性肝細(xì)胞滲透性和代謝的改變分別有利于病毒的傳播和復(fù)制。體外研究顯示，肝細(xì)胞的極性可限制HCV進(jìn)入肝細(xì)胞內(nèi)，而HCV可通過促進(jìn)HIF依賴性VEGF的轉(zhuǎn)錄激活來克服這種障礙，使肝細(xì)胞去極化，有助于HCV播散。VEGF是已得到很好認(rèn)識的受HIF-1α調(diào)控的因子，在血管生成和HCV感染中有著不可或缺的作用，并和血管新生增加有關(guān)，這提示受HIF調(diào)控的基因在促進(jìn)病毒生命周期方面起著關(guān)鍵作用。

高通量代謝組學(xué)的發(fā)展為病毒如何調(diào)節(jié)宿主代謝提供了新的視野。對HCV感染細(xì)胞的代謝特點(diǎn)進(jìn)行研究顯示，細(xì)胞從能量消耗表型轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰勘Ｗo(hù)表型，從而促進(jìn)被感染細(xì)胞的存活。鑒于HIF-1α在調(diào)節(jié)糖代謝方面的作用，HCV對HIF-1α的穩(wěn)定作用可能會誘導(dǎo)一種轉(zhuǎn)化的代謝表型，以利病毒復(fù)制。Ripoli等報道，HCV感染可導(dǎo)致肝細(xì)胞線粒體氧化磷酸化減弱，糖酵解酶表達(dá)增加；這些發(fā)現(xiàn)表明肝細(xì)胞的代謝發(fā)生了向有氧糖酵解的漂移，有助于闡明病毒感染對宿主生物能量學(xué)的影響。而且，這些結(jié)果還提示HIF-1α依賴性細(xì)胞程序的重排可能會促進(jìn)HCV相關(guān)性肝細(xì)胞癌(HCC)的發(fā)病機(jī)制。

(五)肝細(xì)胞癌

1. HIFs在HCC發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制中的作用HCC最主要的危險因素是慢性肝病，尤其是HBV和HCV感染。盡管HCC的治療取得了很大進(jìn)展，但絕大數(shù)患者都在診斷后一年內(nèi)因?yàn)閺?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移而死亡。由于血管系統(tǒng)的缺陷和高強(qiáng)度的代謝活動，缺氧就成為HCC等實(shí)體腫瘤的突出特征，并與預(yù)后不良和對化放療不敏感有關(guān)。HIF介導(dǎo)的基因表達(dá)涉及HCC轉(zhuǎn)移的各個步驟，包括上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)、細(xì)胞外基質(zhì)侵入、內(nèi)滲、外溢和次生轉(zhuǎn)移灶等。HIF-1α在HCC中的表達(dá)是術(shù)后臨床結(jié)果的消極預(yù)后因素，與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。HBV和HCV 對HIF的穩(wěn)定作用在HCC發(fā)病機(jī)制中的地位有待明確。

HCC等實(shí)體腫瘤的糖酵解水平很高，而缺氧介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答可上調(diào)該通路中的各種酶，包括己糖激酶2(HK2)和乳酸脫氫酶A(LDHA)，從而鞏固和加強(qiáng)這種糖酵解表型。據(jù)報道，糖酵解可為HCC等實(shí)體腫瘤提高能量， HK2表達(dá)的增加可刺激癌細(xì)胞增殖。而在HCC小鼠模型，抑制HK2的表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞凋亡，限制腫瘤生長。LDHA調(diào)控由丙酮酸鹽產(chǎn)生乳酸鹽的過程；體內(nèi)外研究顯示，敲除LDHA可抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。這些報告提示糖代謝在HCC的轉(zhuǎn)移過程中具有某種作用，而HIF-1α信號很可能在其中扮演一種極為重要的角色。穩(wěn)定的HIF-1α可能是有氧糖酵解的驅(qū)動因素之一，這是在許多腫瘤中觀察到的一種表型。

Ma等報道一種HCC小鼠模型，其惡變肝細(xì)胞糖異生減少，應(yīng)用一種合成類固醇恢復(fù)糖異生水平，可抑制HCC細(xì)胞的生長。自從發(fā)現(xiàn)HIF-2α的表達(dá)可減少肝臟糖異生以來，人們推測HIF-2α在HCC的發(fā)病機(jī)制中具有某種正調(diào)節(jié)作用。但新近有數(shù)據(jù)顯示HIF-2α在HCC小鼠模型中的超表達(dá)可抑制腫瘤生長，這突出表明今后還需進(jìn)一步研究這種轉(zhuǎn)錄因子在HCC轉(zhuǎn)移中的作用。

2. HIFs和HCC微環(huán)境HCC的微環(huán)境包括細(xì)胞外基質(zhì)中的腫瘤細(xì)胞各種間質(zhì)細(xì)胞。間質(zhì)細(xì)胞包括成血管細(xì)胞、免疫細(xì)胞和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)等。越來越多的證據(jù)表明，間質(zhì)細(xì)胞在解釋腫瘤進(jìn)展和治療應(yīng)答方面具有重要作用，尤其是在乳腺癌、肺癌和胰腺癌。微環(huán)境的改變，尤其是間質(zhì)成纖維細(xì)胞的改變，可影響腫瘤在相鄰上皮細(xì)胞的啟動，促使腫瘤進(jìn)展。而且，微環(huán)境對化療耐藥和藥物輸送也有重要影響。因此，靶向于間質(zhì)細(xì)胞以消除它們對腫瘤的支撐作用，是一種很有吸引力的治療策略。但對于低氧如何誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞應(yīng)答，以及所誘導(dǎo)的各種旁分泌途徑如何促進(jìn)HCC生長，目前尚不清楚。在大多數(shù)腫瘤中，CAFs是最具優(yōu)勢的細(xì)胞類型之一，但有關(guān)HCC中這種細(xì)胞類型的研究十分有限。Lin等報道兩種人類CAF細(xì)胞系能上調(diào)與增殖、轉(zhuǎn)移、侵潤及血管發(fā)生相關(guān)的細(xì)胞因子和生長因子(APLN、CCL2、CCL26、CXCR4、IL-6、MUC1、LOXL2、PDGFA、PGK1、VEGFA)的表達(dá)，從而促進(jìn)HCC。新近一項(xiàng)研究顯示，HCC衍生的腫瘤細(xì)胞可分泌溶血磷脂酸(LPA)，激活腫瘤周圍的成纖維細(xì)胞，使之采取一種CAF表型，從而加速HCC進(jìn)展。抑制LPA可阻斷小鼠模型成肌纖維細(xì)胞的分化轉(zhuǎn)移和腫瘤進(jìn)展，從而提供了一種令人激動的治療新靶點(diǎn)。鑒于大量報道顯示LPA能激活PI3K并穩(wěn)定脂肪細(xì)胞、結(jié)腸腫瘤細(xì)胞和PC3前列腺腫瘤細(xì)胞中的HIF-1α，因此推測在HCC中存在HIF-1α依賴性通路。

HCC常與大量的淋巴細(xì)胞相關(guān)，包括腫瘤特異性CD8細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷性T細(xì)胞(NKT)和NK細(xì)胞。多種免疫調(diào)節(jié)機(jī)制與抗腫瘤免疫的抑制密切相關(guān)，包括表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的PD-1等促凋亡分子、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和免疫抑制性髓源性細(xì)胞(MDSCs)的募集，以及可溶性NKG2D配體(MICA/B)所致NK應(yīng)答的滅活。新近報道PD-1配體是HIF-1α的直接靶點(diǎn)，這提示同時阻斷PD-L1和HIF-1α可能是治療HCC的一種新方法。Doedens等報道，HIFs可影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)以及病毒特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的效應(yīng)分子和共刺激-抑制性因子，突出顯示這可能是促進(jìn)病毒和腫瘤清除的一種新策略。因此，HIF-1α可對腫瘤和血管細(xì)胞施加直接作用，優(yōu)選出由趨化因子介導(dǎo)的抑制性促血管生成性T細(xì)胞亞群。總之，目前對缺氧如何影響固有免疫細(xì)胞及其在HCC發(fā)生中的作用知之尚少，有必要進(jìn)一步研究HIFs在抗HCC免疫中的作用。

3. HIFs和HCC的治療HCC患者實(shí)際上既有肝癌，又有慢性肝病基礎(chǔ)。根據(jù)不同的情況，可采取癌灶切除、肝移植、經(jīng)肝動脈插管栓塞化療(TACE)、化療、放療、免疫治療和/或生物治療等。其中，TACE雖可在一定程度上改善HCC患者的生存率，但疾病進(jìn)展和治療引起的癌灶缺氧可促進(jìn)腫瘤的血運(yùn)重建、侵潤和轉(zhuǎn)移。

靶向于HIF調(diào)控的VEGF的抗血管生成劑可用作包括HCC在內(nèi)的多種腫瘤的一線和二線治療。靶向于VEGF受體的激酶抑制劑索拉菲尼和舒尼替尼已分別用于HCC和胃腸道間質(zhì)腫瘤的治療。隨機(jī)安慰劑對照3期臨床試驗(yàn)證實(shí)多靶點(diǎn)的激酶抑制劑索拉菲尼可改善晚期HCC患者的生存情況。但這種改善其實(shí)意義并不突出，僅能延長生存期2～3個月，且并無任何臨床或分子生物標(biāo)記物來判斷哪些患者最有可能受益。其他多種靶向于VEGF的藥物(包括舒尼替尼和布立尼布)未能被證實(shí)有任何生存受益，不論是作為一線或二線治療藥物，大部分患者在診斷后的一年內(nèi)因腫瘤進(jìn)一步轉(zhuǎn)移而死亡。治療誘導(dǎo)的腫瘤缺氧在放療、化療、抗血管生成劑和血管破壞劑治療時均可見到。新近研究顯示，抗VEGF抑制劑的耐藥與更具侵襲性/轉(zhuǎn)移性的腫瘤表型和HIF依賴性血管生成通路的激活相關(guān)。

HCC的3期臨床試驗(yàn)失敗率高，這迫使科學(xué)家們對試驗(yàn)設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，同時考慮腫瘤的分子特性以便選擇最有可能產(chǎn)生應(yīng)答的患者進(jìn)行治療。尋找治療應(yīng)答的分子預(yù)報器已成為臨床腫瘤學(xué)研究的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐內(nèi)容，而這有賴于“致癌成癮(oncogenic addiction)”概念的建立。“致癌成癮”概念是基于個體的、對有利于腫瘤進(jìn)展的特異性分子改變的事先認(rèn)知。與肺癌、結(jié)腸癌或乳腺癌等其他實(shí)體腫瘤不一樣的是，目前對HCC的致癌成癮環(huán)路信息所知有限。大量研究聚焦于HCC的分子特性，旨在識別可預(yù)測腫瘤治療結(jié)果的基因標(biāo)志物。迄今為止，各研究之間的一致性十分有限，這可能反映了HCC的異質(zhì)性。

Van Malenstein等報道一種與HCC不良預(yù)后相關(guān)的七基因缺氧基因標(biāo)志物，但其定義的缺氧腫瘤基因標(biāo)志物乃是與一種體外對照樣品對比mRNA特點(diǎn)而得出的，而這種對照樣品中的HepG2肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞是在2%氧濃度條件下培養(yǎng)72 h。但據(jù)報道，HIF的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄活性在缺氧24～48 h后最佳，至72 h時已顯著下降，這就對上述研究結(jié)論形成了限制。新近Nault等報道一種HCC五基因分值，與不同臨床背景下肝切除術(shù)后患者的生存情況有關(guān)，其中RAN、TAF9、RAMP3和HN1為四個新發(fā)現(xiàn)的基因，反映了與HCC預(yù)后相關(guān)的信號傳導(dǎo)通路。這些基因是否受HIFs的調(diào)控轉(zhuǎn)錄，這些新的生物標(biāo)志物又將如何指導(dǎo)臨床對患者進(jìn)行分層治療，值得關(guān)注。

4. HIF作為治療靶點(diǎn)的可能性數(shù)項(xiàng)體內(nèi)研究突顯了靶向于HIF通路以抑制腫瘤進(jìn)展的價值，以及通過調(diào)節(jié)缺氧腫瘤微環(huán)境以改善VEGF靶向療法的效能。在臨床前模型中，靶向于HIFs的策略能限制γ放療和抗血管生成劑治療所誘導(dǎo)的腫瘤缺氧過程中不需要的效能，從而顯著提高療效。許多直接或間接靶向于HIF的藥物已在進(jìn)行臨床前研究或臨床試驗(yàn)，主要是作為治療晚期腫瘤的一種新手段。

HIF-1α拮抗劑EAN-2968是一種被鎖定的反義寡核苷酸，能特異性下調(diào)HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)。體內(nèi)研究顯示，其可特異而持久地下調(diào)小鼠肝臟中的HIF-1α和VEGF，對人類異種移植物也具有抗腫瘤作用。

應(yīng)用α-酮戊二酸衍生物誘導(dǎo)PHD酶活性是一種新的靶向于腫瘤缺氧區(qū)的療法。這種療法可同時減少經(jīng)由HIF-1α和2α的信號傳導(dǎo)，從而較僅靶向于一種HIF亞型的治療策略具有能更強(qiáng)的殺腫瘤效應(yīng)。

超氧化物歧化酶模擬物等能抑制ROS產(chǎn)生的藥物也能降低HIF水平。其他可間接抑制HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的藥物包括雷帕霉素等mTOR抑制劑，AKT活性抑制劑，以及NVP-BEZ235等具有雙重特異性的mTOR/PI3K抑制劑。這些制劑靶向于與HIF軸相平行的其他重要信號傳導(dǎo)通路。

四、總結(jié)和展望

近年的研究突出顯示，HIFs可調(diào)控細(xì)胞代謝、炎癥、血管再生和增殖過程中大量基因的轉(zhuǎn)錄，與代謝性疾病、脂肪性肝炎、病毒性肝炎及HCC等多種肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。HIF的表達(dá)及相關(guān)轉(zhuǎn)錄活性受到低氧張力、炎癥和病毒感染等的調(diào)控。這說明HIFs在慢性肝病和HCC的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。當(dāng)前的認(rèn)識主要是基于小鼠模型，今后有必要進(jìn)一步在人類驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)，研發(fā)整合有肝氧水平的體外培養(yǎng)體系，以期進(jìn)一步明確氧張力對離體肝臟固有居留細(xì)胞和浸潤的免疫細(xì)胞功能的影響。HBV、HCV、EBV和CMV等病毒均可誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)假性缺氧。病毒對HIF通路的這種劫持效應(yīng)可能有利于其生命周期的多個環(huán)節(jié)，但同時也為控制病毒復(fù)制及相關(guān)疾病提供了新的治療靶點(diǎn)，亦即靶向于HIFs的藥物對各種炎性肝病和HCC等具有潛在治療價值[1]。

[1]Wilson GK, Tennant DA, McKeating JA. Hypoxia inducible factors in liver disease and hepatocellular carcinoma: Current understanding and future directions. J Hepatol, 2014, 61: 1397-1406.

(本文編輯：張苗)

2016-02-16)

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