李毅堅

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葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因診斷新技術(shù)研究

李毅堅

目的研究分析用于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥基因診斷的多重SNaPshot基因診斷技術(shù)這一新技術(shù)的檢出效果，以便于有效地進(jìn)行新生兒篩查，和疾病的預(yù)防。方法選取2014年7月至2015年5月既往有G6PD生育史，或孕前篩查、新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的該病患者和G6PD缺乏癥高風(fēng)險胎兒156例為研究對象，并將研究對象隨機分為觀察組和對照組，每組78例。對照組采用傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD)比值法，觀察組則采用新的基因診斷技術(shù)-多重SNaPshot基因診斷，分別檢測對G6PD和編碼該酶的基因診斷，以基因測序結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”對比2組的檢出結(jié)果。結(jié)果觀察組待檢者檢出57例患有由基因突變導(dǎo)致的G6PD缺乏癥，總異常率為73.08%(57/78),包括錯義突變的A95G型、G392T型、G1376T型、G1388A型分別為5例、3例、17例、27例，其發(fā)生率分別為6.41%、3.85%、21.79%、34.62%，同義突變5例，發(fā)生率為6.41%，男、女異常率不同，女性均為雜合子；G6PD/6PGD比值法測定的78例待檢者血樣中總共有52例比值結(jié)果<1.0，總陽性率為66.67%(52/78),其中男性、女性的陽性例數(shù)分別為30、22；觀察組采用的SNaPshot基因診斷技術(shù)，測出的突變類型及每種類型的突變數(shù)均與測序結(jié)果完全一致，而對照組采用的G6PD/6PGD比值法測定酶活性，只能測定錯義突變，且存在漏診，準(zhǔn)確率為96.3%，無法檢出同義突變。結(jié)論SNaPshot基因診斷技術(shù)可以有效地檢出是那種基因突變導(dǎo)致G6PD缺乏，準(zhǔn)確率高，有較高的臨床推廣應(yīng)用價值。

葡萄糖磷酸脫氫酶缺乏；診斷，基因；新技術(shù)研究

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶[1-4](glucose-6phosphate dehydrogenase，G6PD)是由管家基因編碼的一種廣泛存在于各個組織、細(xì)胞中的一種必須酶，參與磷酸戊糖代謝旁路核酸的合成，進(jìn)而維持還原型谷胱甘肽保護(hù)紅細(xì)胞免受氧化物質(zhì)氧化損傷的作用。當(dāng)其缺乏時，紅細(xì)胞極易受到氧化損傷損害出現(xiàn)溶血性疾病，變現(xiàn)為黃疸甚至出現(xiàn)核黃疸。G6PD基因突變是導(dǎo)致該基因缺乏的主要原因，屬于X連鎖不完全顯性遺傳，應(yīng)該早期診斷和預(yù)防。目前，其診斷的方法包括酶學(xué)診斷和基因診斷兩大類，酶學(xué)診斷法包括G6PD/6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6PGD)比值法、高鐵血紅蛋白還原實驗、熒光斑點法等；常規(guī)的基因診斷法包括等位基因特異性擴(kuò)增(ARMS)、等位基因寡核苷酸探針雜交(ASO)、錯配堿基聚合酶鏈反應(yīng)/限制性內(nèi)切酶圖譜分析(miswatch-PCR/RE)以及各種梯度的凝膠電泳等[5-7]，目前G6PD酶活性檢測方法因其具有操作簡單、方便快捷、價格低廉等諸多優(yōu)點已在臨床診斷和篩查中被廣泛應(yīng)用[8,9]。然而，對于不同的基因突變，受累的G6PD功能位點不同而臨床表型不同，同時，該法對女性雜合子攜帶者檢測率低。而常規(guī)的基因診斷方法不可避免出現(xiàn)操作繁瑣、通量低、耗時長、出現(xiàn)漏診、誤診，因此急需研究一種新的基因診斷技術(shù)，為新生兒篩查和遺傳干預(yù)提供更為有效的診斷方法，提高人口質(zhì)量。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年7月至2015年5月我院的156例既往檢查生育G6PD缺陷患兒的孕婦及孕前篩查等檢查懷疑為G6PD缺乏癥的高風(fēng)險胎兒，其中男90例，女66例；平均胎齡(4.2±21)周，平均年齡(22.8±17.5)歲。采用隨機數(shù)表法將其分為觀察組和對照組，每組78例。2組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1入選標(biāo)準(zhǔn)[10,11]：追蹤調(diào)查，曾生育過G6PD缺乏癥患者的孕婦；經(jīng)一般孕前檢查和新生兒篩查初步判定為G6PD缺乏癥患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合張之南等主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)：違背倫理道德的參與研究者；其他血液學(xué)疾病導(dǎo)致的溶血性疾病。

1.3檢查方法

1.3.1標(biāo)本采集：抽取受檢者外周血2 ml于試管中，加入肝素抗凝，6PGD缺乏癥高風(fēng)險胎兒則于適宜胎齡時抽取羊水10 ml。羊水和外周血均采用鹽析法提取DNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2G6PD/6PGD比值法測定酶活性:取抗凝全血15 μl，加入蒸餾水200 μl，使紅細(xì)胞破裂溶解，以釋放DNA，每份樣本取試管兩只，標(biāo)上序號1、2號分別加入溶解的血液50 μl,取G6P工作液和6PG工作液各50 μl，分別加入1、2號兩只試管，使之充分混勻，然后立即置于37℃水浴箱保溫20 min，取出試管后立即在兩只試管內(nèi)加入稀釋的的終止液2 ml以終止反應(yīng)。以蒸餾水作為空白對照，在650 nm波長處測量兩管的吸收光度值，然后獲得兩者的比值。

1.3.3多重SNaPshot技術(shù)進(jìn)行基因診斷:用QIAamp DNA Blood Mini Kit按試劑盒說明要求提取全血基因組DNA，通過多重SNaPshot技術(shù)檢測25個已報到的我國人群G6PD基因突變位點。步驟：①PCR產(chǎn)物純化。②延伸反應(yīng)。③SNaPshot產(chǎn)物純化。④延伸產(chǎn)物檢測和分析。

1.4效果評價[12,13]G6PD/6PGD比值法的正常參考值為1.0～2.3，比值結(jié)果<1.0為G6PD缺乏，判斷為陽性，比值結(jié)果≥1.0為G6PD不缺乏，判斷為陰性。多重SNaPshot技術(shù)進(jìn)行基因診斷的結(jié)果判讀：只在某個突變位點點對點對應(yīng)的峰位置出現(xiàn)野生型顏色的峰值則為野生型；只出現(xiàn)突變型顏色的峰值則為純合突變型或半合子；同時出現(xiàn)野生型和突變型顏色的峰值則為雜合突變；兩個或以上出現(xiàn)突變型顏色的峰值表明存在復(fù)合突變，必須結(jié)合患者性別來確定基因型。

2　結(jié)果

2.1觀察組基因診斷結(jié)果觀察組78例待檢者檢出57例患有由基因突變導(dǎo)致的G6PD缺乏癥，總異常率為73.08%(57/78),包括錯義突變的A95G型、G392T型、G1376T型、G1388A型分別為5例、3例、17例、27例，其發(fā)生率分別為6.41%、3.85%、21.79%、34.62%，同義突變5例，發(fā)生率為6.41%，男、女異常率不同，女性均為雜合子。見表1。

表1　觀察組基因診斷結(jié)果

2.2對照組酶活性檢測結(jié)果G6PD/6PGD比值法測定的78例待檢者血樣中總共有52例比值結(jié)果<1.0，認(rèn)為患有G6PD乏癥，判斷為陽性，總陽性率為66.67%(52/78),其中男性、女性的陽性例數(shù)分別為30、22例。差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.3觀察組與對照組診斷對比以基因測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，觀察組采用的SNaPshot基因診斷技術(shù)，測出的突變類型及每種類型的突變數(shù)均完全正確，準(zhǔn)確率達(dá)100%，與之相比，對照組采用的G6PD/6PGD比值法測定酶活性，只能測定錯義突變，且存在漏診，準(zhǔn)確率為96.3%，無法檢出同義突變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2　對照組酶活性檢測結(jié)果

表3　觀察組與對照組診斷對比

3　討論

G6PD缺乏癥是一種較常見的酶缺乏所致的一種疾病，據(jù)報道，全球每一百個人中就有5人患有該病，且呈現(xiàn)一種地域性和民族性的分布特點，資料統(tǒng)計表明，非洲、南歐、中東、東南亞發(fā)病率最高，而我國則多見于廣東、廣西、云南、四川等西南地區(qū)，其中尤以廣東、廣西兩省最甚，具有南高北低的態(tài)勢[14]。由于基因突變的發(fā)生，G6PD合成減少或缺乏的量變進(jìn)而導(dǎo)致紅細(xì)胞內(nèi)G6PD活性降低的質(zhì)變而引起的氧化還原障礙[15,16]。由于量變的不同導(dǎo)致各個患者臨床表現(xiàn)的不全相同，有些無臨床癥狀，而有的表現(xiàn)為新生兒黃疸、藥物誘導(dǎo)性黃疸、感染等因素誘導(dǎo)的黃疸、蠶豆病、慢性非球性紅細(xì)胞溶血性貧血，更有重者，新生兒期即出現(xiàn)重癥的紅細(xì)胞破裂而致的核黃疸，進(jìn)而造成死亡。因此，應(yīng)避免食用蠶豆等氧化性較高的食物和伯氨喹等氧化應(yīng)激性藥物[17]。

本文通過研究發(fā)現(xiàn)，新的基因診斷技術(shù)-多重SNaPshot基因診斷，從遺傳物質(zhì)DNA的水平，不僅可以診斷是否有G6PD缺乏，準(zhǔn)確率高，而且可以檢測出是由于哪種基因突變造成的，結(jié)果顯示主要由錯義突變所致，包括A95G型、G392T型、G1376T型、G1388A型，符合范玉君等[18]的報道，我國人群主要以這幾種類型為主，也包括一些復(fù)合突變，導(dǎo)致G6PD活性進(jìn)一步降低，加重病情，且不同基因型突變累計的功能位點的不同臨床表型也不同，對于其準(zhǔn)確的診斷十分重要，以指導(dǎo)更好地疾病預(yù)防。與之相對比的目前臨床常用的酶活性測定法，G6PD/6PGD比值法雖然操作簡單，快速獲得結(jié)果，但從基因測序結(jié)果看，不僅漏檢了同義突變的類型，錯義突變導(dǎo)致的某些酶活性異常亦未能檢出，準(zhǔn)確率不能達(dá)到100%，賀靜等[12]也報道過，可能是由于該突變在某些個體中致病輕，從酶活性角度不易辨識而致漏診，這樣極易使患者忽視該病，不注意平時的飲食、服藥等生活，最終釀成大禍。由于目前尚無根治該病的方法，簡便、準(zhǔn)確地的基因水平的疾病診斷和篩查，做好預(yù)防至關(guān)重要。

綜上所述，SNaPshot基因診斷技術(shù)可以有效地檢出是那種基因突變導(dǎo)致G6PD缺乏，準(zhǔn)確率高，可以用于新生兒篩查和G6PD缺乏癥的預(yù)防。

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An new diagnostic technique for gene diagnosis of glucose 6 phosphate dehydrogenase deficiency diseases

LIYijian.

Desect1mentofClinicalLaboratory,People’sHospitalofNanhaiDistrict,FoshanCity,Guangdong,Foshan528200,China

ObjectiveTo investigate the detection effect of multiple SNaPshot gene diagnosis technique in the diagbosis of glucose 6 phosphate dehydrogenase (G6PD) deficiency diseases in order to screen and prevent effectively neonatal diseases.MethodsOne hundred and fifty-six fetuses with G6PD deficiency diseases or with high risk of G6PD deficiency diseases who were diagnosed by progestation screening or neonatal screening in our hospital from July 2014 to May 2014 were enrolled in the study.The research objects were randomly divided into observation group and and control group,with 78 fetuses in each group,the gene diagnosis for the coding gene of 6PGD was performed by traditional gene detection technique (specific value method) in control group or by multiple SNaPshot genetic diagnosis technique in observation group, respectively.The detection results were compared between two groups by taking gene sequencing results as “gold standard”.ResultsIn observation group,57 patients with G6PD deficiency diseases that were caused by genetic mutation were detected,with total abnormal rate being 73.085 (57/78), including missense mutation A95G, G392T, G1376T, G1388A,respectively in 5 cases, 3 cases, 17 cases,27 cases,respectively, with the incidence rate being 6.41%, 3.85%, 21.79%, 34.62%,respectively. Moreover there were 5 cases of samesense mutation, the incidence rate was 6.41%, and the abnormal rate was different between males and females that were all heterozygous. Among 78 blood samples detected by G6PD/6PGD specific value method,the specific value<1.0 in 52 cases,with total positive rate being 66.67% (52/78),in which the positive cases in male and female were 30 cases,22 cases,respectively.The mutation types and mutation number in every type detected by multiple SNaPshot genetic diagnosis technique were completely concordant with those detected by gene sequencing,however,the enzymic activity detection by G6PD/6PGD specific value method could only determine missense mutation,with accuracy being 96.3%, however,which could not detect samesense mutation.ConclusionThe SNaPshot gene diagnosis technique can effectively detect the gene mutations which lead to G6PD deficiency diseases,with higher accuracy,thus,which is worth using widely in clinical practice.

glucosephosphate dehydrogenase deficiency;gene diagnosis;new technique research

2015-11-13)

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.15.003

528200廣東省佛山市南海區(qū)人民醫(yī)院檢驗科

R 394.112

A

1002-7386(2016)15-2251-03

項目來源：佛山市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計劃項目(編號：201412011)