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(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津　300203)

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Aβ蛋白淀粉樣變成分在正常人血小板膜的表達(dá)

李曉亮蘭杰葛鵬蘇桂新趙琢1盧金海1鄭芳孫續(xù)國(guó)

(天津醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，天津300203)

目的探討正常人血小板中是否存在Aβ蛋白淀粉樣變成分。方法篩選正常人群340例，采用Sysmex-200型血細(xì)胞分析儀測(cè)定血液血小板數(shù)量(PLT)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)，進(jìn)一步提純血小板，將血小板分成兩部分，一部分用于提取血小板膜蛋白，另一部分用硫磺素T(ThT)熒光探針檢測(cè)血小板膜上淀粉樣變?？笰β抗體檢測(cè)淀粉樣變前多肽的免疫反應(yīng)。Western印跡觀察Aβ蛋白分子聚合。結(jié)果ThT熒光探針檢測(cè)血小板幾乎全部顯示陽(yáng)性反應(yīng)。進(jìn)一步抗Aβ免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)綠色熒光與Aβ抗體反應(yīng)陽(yáng)性部位重疊。SDS-PAGE分析血小板提取的蛋白成分含有大分子Aβ聚合物。結(jié)論正常人血小板中存在Aβ淀粉樣變成分，可能參與AD患者淀粉樣變的發(fā)生。

淀粉樣變；血小板；探針；熒光

阿爾茨海默病(AD)患者腦組織和血管中有大量淀粉樣變沉積，且證實(shí)淀粉樣變成分為Aβ多肽〔1〕，最近報(bào)道血液中Aβ多肽主要來源于血小板，血小板可能參與AD淀粉樣變的形成〔2〕。淀粉樣前體蛋白(APP)形成淀粉樣變，血液中存在Aβ成分，多數(shù)學(xué)者主張，利用硫磺素T(ThT)探針能夠檢測(cè)淀粉樣變聚合物和淀粉樣變纖維成分，本組已經(jīng)多次發(fā)表論文顯示，T熒光探針能夠清晰與淀粉樣變結(jié)合〔3,4〕，結(jié)果提示與淀粉樣變結(jié)合特異，用于確定淀粉樣變成分。利用淀粉樣變熒光探針研究分析血小板淀粉樣變成分，進(jìn)一步結(jié)合抗Aβ免疫組織化學(xué)確定淀粉樣變類型，為解析AD淀粉樣變形成的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料收集志愿者340例，均經(jīng)過天津醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢查和臨床檢查，無(wú)肝腎心腦代謝病等疾病，按年齡分為0～20歲和60～80歲兩組，采集EDTA抗凝血4 ml用于血小板分析，血液2 ml分離血漿用于生物化學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)。

1.2血小板分離試劑、血小板膜蛋白成分的分離利用Sysmex-100型血細(xì)胞分析儀(希森美康，日本)及配套試劑按照說明進(jìn)行操作，測(cè)定末梢血液血小板計(jì)數(shù)(PLT)、血小板分布寬度(PDW)、平均血小板體積(MPV)、血小板比容(PCT)和大型血小板比例(P-LCRs)指標(biāo)。分離血小板，抗凝血離心(15 min)，取上層富含血小板血漿(PRP),然后離心(15 min),去掉上清血漿，底部沉淀即為血小板，收集血小板，制備血小板涂片，配制0.1 mol/L硫磺素T(ThT)溶液，溶液與血液的比例為3∶1，室溫作用5 min，利用熒光顯微鏡判定淀粉樣變熒光〔5〕。

1.3Western印跡法測(cè)定血小板膜中Aβ成分分別用兩組不同年齡段(0～20歲、60～80歲)研究對(duì)象血漿、血小板膜蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡分析4%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，考馬斯亮藍(lán)溶液對(duì)蛋白進(jìn)行染色。免疫印跡實(shí)驗(yàn)，鼠抗A單克隆抗體孵育60 min，10 mmol/L PBS(pH7.4)緩沖液洗滌，酶標(biāo)記二抗體孵育60 min，多色熒光化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(CE)成像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件、組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1血小板數(shù)量及血小板指數(shù)分析老年人PLT明顯減少(P<0.05)，而其余四項(xiàng)指標(biāo)在成熟末梢血小板中未見有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

2.2利用ThT探針分析血小板淀粉樣變成分熒光探針顯示所有研究對(duì)象的血小板均存在熒光染色陽(yáng)性，見圖1。

2.3Western印跡檢測(cè)Aβ淀粉樣變提取分離血小板的膜蛋白成分，經(jīng)過SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)合抗Aβ抗體免疫反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)血漿中存在淀粉樣變蛋白，血小板膜中Aβ蛋白反應(yīng)陽(yáng)性，在43 kD和22 kD附近出現(xiàn)蛋白分子帶，提示有Aβ聚合物的存在，見圖2。

表1　不同年齡組末梢血血小板相關(guān)指標(biāo)比較±s)

A：可見光觀察血小板(箭頭所示)；B：ThT熒光，箭頭所示ThT染色血小板圖1　熒光顯微鏡觀察ThT熒光染色(×400)

A、B：分別加入0～20歲和60～80歲血漿樣本；C、D：0～20歲和60～80歲血小板膜蛋白標(biāo)本圖2　Western印跡分析血小板膜Aβ多肽成分

3　討　論

研究表明Aβ來自其前體蛋白APP〔6〕，通過β和 γ分泌酶作用于APP，產(chǎn)生各種長(zhǎng)度Aβ片段和一個(gè)較小的碳末端片段(CTFγ)〔7〕。人類血小板表達(dá)所有APP形成Aβ的酶，血小板可能通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)激活參與AD淀粉樣變的形成。最近報(bào)道血小板通過自身生物功能參與AD患者淀粉樣變形成〔8〕，但是未明確是否參與淀粉樣變形成。探討血小板來源Aβ是否參與AD患者淀粉樣變形成將有利于解析其淀粉樣變形成的分子機(jī)制。前期我們報(bào)道了測(cè)定組織淀粉樣變的方法〔9〕，為分析細(xì)胞淀粉樣變奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。本文發(fā)現(xiàn)血小板膜中存在與Aβ抗體發(fā)生免疫反應(yīng)區(qū)帶，分子量明顯高于(Aβ40、Aβ42)多肽，提示存在Aβ集合分子，血小板特異性熒光染色陽(yáng)性，說明血小板存在淀粉樣變成分。

1Hampel H,Shen Y,Walsh DM,etal.Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕.Exp Neurol,2010;223(2):334-46.

2Randriamboavonjy V,Sopova K,Stellos K,etal.Platelets as potential link between diabetes and Alzheimer's disease〔J〕.Curr Alzheimer Res,2014;11(9):862-8.

3孫續(xù)國(guó)，劉金平，王慶艷，等.過氧化修飾與淀粉樣沉積形成〔J〕.中國(guó)煤炭工業(yè)雜志，2007；10(12)：1345-7.

4蘭杰，李曉亮，薛蓉，等.AD患者血漿淀粉樣變程度、血清總膽固醇水平、全血黏度變化及其相關(guān)性〔J〕.山東醫(yī)藥，2014；27(54)：11-3,17.

5Meyer-Luehmann M,Spires-Jones TL,Prada C,etal.Rapid appearance and local toxicity of amyloid-beta plaques in a mouse model of Alzheimer's disease〔J〕.Nature,2008；451(179):720-4.

6Dobrowolska JA,Kasten T,Huang Y,etal.Diurnal patterns of soluble amyloid precursor protein metabolites in the human central nervous system〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e89998.

7Purandare N,Burns A,Morris J,etal.Association of cerebral emboli with accelerated cognitive deterioration in Alzheimer's disease and vascular dementia〔J〕.Am J Psychiatry,2012；169(3):300-8.

8Plagg B,Marksteiner J,Kniewallner KM,etal.Platelet dysfunction in hypercholesterolemia mice,two Alzheimer's disease mouse models and in human patients with Alzheimer's disease〔J〕.Biogerontology,2015;16(4):543-58.

9趙輝,潘濤,胡可勝,等.老年性關(guān)節(jié)病變關(guān)節(jié)組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)TTR淀粉樣變〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2011；31(2)：239-41.

〔2016-01-07修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.080

國(guó)家自然科學(xué)基金(30973157)

孫續(xù)國(guó)(1965-)，男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事淀粉樣變的發(fā)病機(jī)制與分子診斷的研究。

李曉亮(1988-)，男，碩士，主要從事血小板淀粉樣變成分的研究。

R741.03

A

1005-9202(2016)14-3524-02；

1天津檢驗(yàn)檢疫理化檢驗(yàn)中心