吳相春　王少卿　唐　璐　朱文浩　高　穎

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京　100700)

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大腦中動脈栓塞大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的變化規(guī)律

吳相春王少卿唐璐朱文浩高穎

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，北京100700)

目的探討大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸變化規(guī)律。方法SD大鼠70只隨機分為正常組、假手術(shù)組、手術(shù)組，假手術(shù)組與手術(shù)組按不同時間分為6 h、48 h、72 h組，每組10只。以大腦中動脈栓塞法建立MCAO大鼠模型，分別在手術(shù)完成后6 h、48 h、72 h腹主動脈取血，放射免疫法檢測大鼠血漿促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)、血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和血清皮質(zhì)酮(CORT)的水平。結(jié)果與假手術(shù)組比較，MCAO大鼠在3 h時血漿CRH，血清ACTH、CORT增高，在48 h、72 h時血漿CRH，血清ACTH降低，血清CORT水平進一步增高。結(jié)論MCAO大鼠存在明顯的HAP軸功能紊亂，調(diào)節(jié)紊亂的HPA軸功能可能為腦血管疾病的防治提供新的途徑。

大腦中動脈栓塞；下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸

下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸是機體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)重要的組成部分，在腦血管疾病中起重要作用，影響缺血性腦血管疾病的發(fā)病及長期預后〔1～5〕，大腦中動脈栓塞(MCAO)大鼠模型是缺血性腦卒中研究的常用模型〔6〕，本研究探討MCAO模型大鼠HPA軸變化規(guī)律。

1　材料與方法

1.1動物健康清潔級雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量280～300 g，由北京華阜康生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2009-0007。飼養(yǎng)于北京東直門醫(yī)院中醫(yī)腦病研究室動物房，光照12 h/d，溫度20℃～23℃，相對濕度40%～60%。正常飼料飲食，保持充足的飲水。

1.2試劑促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、人促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、腎上腺皮質(zhì)酮(CORT)放射免疫分析試劑盒，由北京北方生物技術(shù)研究所提供。MCAO栓線(A4級)由北京沙東生物技術(shù)有限公司提供。

1.3方法

1.3.1實驗分組將70只SD雄性大鼠按體質(zhì)量隨機分為手術(shù)組、假手術(shù)組、正常組，其中假手術(shù)組和手術(shù)組按照3個時點分為3個亞組：缺血6 h、48 h、72 h組，每個亞組10只。正常組10只。

1.3.2模型制作手術(shù)組動物采用大腦中動脈線栓法制備MCAO動物模型，參照Longa 線栓法〔6〕的基礎上，加以改良，大鼠以3.5%的水合氯醛以10 ml/kg麻醉成功后，仰臥固定，頸部正中切口1.5～2 cm，鈍性分離肌肉，以開瞼器暴露手術(shù)野，分離左側(cè)頸總動脈(CCA)及伴行的迷走神經(jīng)、頸外動脈(ECA)和頸內(nèi)動脈(ICA)，結(jié)扎CCA近心端，然后結(jié)扎ECA近心端，在距離CCA分叉處4 mm處的血管壁上做一個小切口，輕輕插入線身直徑為0.26 mm，線頭硅膠直徑為(0.36±0.02)mm的線栓，使其頭端到達大腦中動脈起始處(從MCA 至ECA 分叉處約2 cm)，以抵觸感為度，將CCA遠心端結(jié)扎，剪掉線栓以及其他的線，在創(chuàng)面上點幾滴青霉素液預防感染?？p合切口。術(shù)后3 h、6 h各評分1次，做好記錄。假手術(shù)組只是不插入栓線，其余步驟同手術(shù)組。縫合傷口，將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫。術(shù)后3 h采用Zea-Longa〔6〕5級4分法標準進行神經(jīng)功能缺損程度評分，0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分：輕微神經(jīng)功能缺損，不能完全伸展右側(cè)前爪;2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，向右側(cè)傾倒;4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。以分值≥1分作為造模成功的入組標準。造模插線操作超過15 min、術(shù)中出血多、麻醉過深呼吸不規(guī)律、術(shù)后3 h仍不能蘇醒的動物不列入統(tǒng)計范圍。

1.3.3大鼠一般情況監(jiān)測模型動物體重、精神、活動情況、皮毛、尾色、大便等。

1.3.4神經(jīng)功能Zea-Longa評分分別在術(shù)后3 h、6 h、24 h、48 h、72 h進行神經(jīng)功能Zea-Longa評分，評分由兩位實驗人員共同觀察記錄，每只大鼠僅做1次神經(jīng)功能Zea-Longa評分，在單盲的條件下進行。

1.3.5放免法檢測血漿CRH、血清ACTH、CORT含量實驗末，大鼠經(jīng)麻醉后由腹主動脈取血6 ml，其中3 ml加入已預先加入30 μl EDTA和40 μl抑的試管中，混勻，4℃，3 000 r/min，離心15 min，取上清置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｆ溆? ml加入空白試管中，4℃，3 000 r/min，離心15 min，取上清置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。放免法檢測血漿CRH、血清ACTH和CORT的含量，由北京康源瑞德生物科技有限公司嚴格按照試劑盒說明書要求進行檢測。

1.4統(tǒng)計學方法采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析、最小顯著差法(LSD)及非參數(shù)檢驗。

2　結(jié)　果

2.1大鼠一般狀況一般大鼠在手術(shù)完成后1.5～2 h蘇醒，手術(shù)完成3 h后開始進行評分，可見大鼠偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)前肢力弱，后肢拖拽，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒，此外還可觀察到48 h、72 h手術(shù)組的大鼠在造模后24 h均出現(xiàn)左側(cè)瞼裂變小，左眼球腫脹并且伴有分泌物，活動減少，身體蜷縮，肢體發(fā)涼，體重明顯下降，肛周污染，稀便，舌質(zhì)紫暗等癥狀，各時點假手術(shù)組動物均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。

2.2各組大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化與假手術(shù)組比較，各時間點手術(shù)組大鼠Zea-Longa神經(jīng)功能評分均明顯增高(P<0.01)。見表1。

2.3各組大鼠血漿CRH的變化與正常組比較，假手術(shù)組6 h及手術(shù)組6 h血漿CRH均增高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，假手術(shù)組48 h、72 h血漿CRH無明顯變化(P>0.05)，手術(shù)組48 h、72 h血漿CRH明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組48 h、72 h血漿CRH明顯降低(P<0.01)；與手術(shù)組6 h比較，手術(shù)組48 h、72 h血漿CRH明顯降低(P<0.01)。見表2。

2.4各組大鼠血清ACTH的變化與正常組比較，假手術(shù)組6 h、48 h和72 h血清ACTH無明顯變化(P>0.05)，手術(shù)組6 h血清ACTH增高，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；手術(shù)組48 h、72 h血清ACTH明顯降低，其中72 h組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組48 h、72 h血清ACTH降低，其中72 h組具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)；與手術(shù)組6 h比較，手術(shù)組48 h、72 h血清ACTH明顯降低，72 h組具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。見表3。

2.5各組大鼠血清CORT的變化與正常組比較，假手術(shù)組6 h、48 h、72 h血清CORT有所升高(P>0.05)，手術(shù)組6 h、48 h、72 h血清CORT明顯升高，以48 h、72 h組具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組48 h、72 h血清CORT升高(P<0.05或P<0.01)。與手術(shù)組6 h比較，手術(shù)組72 h血清CORT明顯升高(P<0.01)。見表4。

表1　各組大鼠神經(jīng)功能Zea-Longa評分變化

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01

表2　各組大鼠血漿CRH變化

與正常組比較：1)P<0.05,2)P<0.01；與假手術(shù)組比較：3)P<0.05；與6 h組比較：4)P<0.01

表3　各組大鼠血清ACTH的變化

與正常組比較：1)P<0.05,與假手術(shù)組比較：2)P<0.05；與6 h組比較：3)P<0.01

表4　各組大鼠血清CORT的變化

與正常組比較:1)P<0.01;與假手術(shù)組比較:2)P<0.05,3)P<0.01;與6 h組比較:4)P<0.01

3　討　論

MCAO 大鼠模型是國內(nèi)外研究腦梗死經(jīng)典模型，改進后的線栓法簡便、易重復，降低了動物死亡率，提高了成功率，復制的可逆性局灶性腦缺血模型是研究腦缺血再灌注損傷較為理想的模型〔7〕。本研究結(jié)果顯示 MCAO大鼠模型造模初期可見偏癱癥狀明顯，表現(xiàn)為右側(cè)肢體廢用或力弱，行走呈順鐘向追尾狀，甚則向一側(cè)傾倒，一側(cè)瞼裂變小，球腫脹并且伴有分泌物，神經(jīng)功能Zea-Longa評分明顯增高。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要組成部分，通過不同途徑和機制來調(diào)節(jié)多巴胺系統(tǒng)、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、交感神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)，形成了復雜的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡。糖皮質(zhì)激素(在人類主要為皮質(zhì)醇，而大鼠主要為皮質(zhì)酮)是HPA軸的終末激素，HPA軸受上級和下級激素的促進和反饋作用，形成了復雜的調(diào)節(jié)通路。隨著年齡增長HPA軸激素水平發(fā)生改變，老年男性較中年男性血清ACTH、COR明顯增高〔8〕。老年(衰老)大鼠血清ACTH、CORT明顯增高〔9〕。在許多情況下，HPA軸激活是機體的適應性反應，但是，過度長期的激活則對機體造成損害，壓力、HPA軸激活與腦卒中關(guān)系密切。糖皮質(zhì)激素在腦卒中結(jié)局中起決定性的作用，在腦卒中患者和缺血性脊椎動物模型上均可見到缺血周邊區(qū)糖皮質(zhì)激素濃度增高與較差的腦卒中結(jié)局有關(guān)〔1〕。短暫性腦缺血發(fā)作引起的急性腦缺血啟動了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和HPA軸一系列復雜的事件，最終導致神經(jīng)元和細胞的損傷。HPA軸激活持續(xù)時間和規(guī)模受CRH的增加，抗利尿激素和糖皮質(zhì)激素，包括皮質(zhì)醇等激素的調(diào)控。研究表明，在中風后激活這些激素可導致神經(jīng)激素的功能障礙，會加劇長期預后，HPA軸的變化在腦缺血中起著重要的作用〔2〕。HPA軸激活是腦卒中早期的普遍現(xiàn)象，皮質(zhì)醇增多癥是其突出表現(xiàn)，細胞因子可能影響HPA軸。腦梗死患者白細胞介素(IL)-6與COR相關(guān)，在腦卒中早期存在HPA軸調(diào)節(jié)異?！?〕。大腦左側(cè)半球與右側(cè)半球卒中影響HPA軸的反應不同，左側(cè)半球卒中患者晨起COR水平明顯增高〔10〕。HPA軸功能紊亂是腦血管病、2型糖尿病及腦卒中的又一危險因素〔4〕。急性腦血管病患者COR、ACTH均高于健康對照組，血清ACTH、COR 含量與腦損傷范圍呈正比〔5〕。

本研究結(jié)果顯示模型大鼠在缺血6 h時，血漿CRH、血清ACTH、CORT增高，隨著缺血時間的延長，血漿CRH、血清ACTH下降，而血清CORT進一步增高，表明MCAO模型大鼠存在明顯的HPA軸功能紊亂。以HPA軸為切入點，調(diào)節(jié)紊亂的HPA軸功能可能為腦血管疾病的防治提供新的途徑。

1Stuller KA,Jarrett B,DeVries AC.Stress and social isolation increase vulnerability to stroke 〔J〕.Exp Neurol,2012;233(1):33-9.

2Radak D,Resanovic I,Isenovic ER.Changes in hypothalamus-pituitary-adrenal axis following transient ischemic attack〔J〕.Angiology,2014;65(8):723-32.

3Johansson A,Olsson T,Carlberg B,etal.Hypercortisolism after stroke partly cytokine mediated〔J〕?J Neurol Sci,1997;147(1):43-7.

4Rosmond R,Bj?rntorp P.The hypothalamic-pituitary-adrenal axis activity as a predictor of cardiovascular disease,type 2 diabetes and stroke〔J〕.J Intern Med,2000;247(2):188-97.

5劉波,張紅宇,牛建平,等.急性腦血管病下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸變化的觀察〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病,2002;9(6):362-3.

6Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,etal.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats 〔J〕.Stroke,1989;21(20):84-91.

7吳松笛,耿曉英.改良線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實驗研究〔J〕.陜西醫(yī)學雜志,2006;35(10):1316-8.

8林英,王衛(wèi)東,葉山東,等.中老年男性下丘腦-垂體-腎上腺軸激素水平改變與生活質(zhì)量關(guān)系的研究〔J〕.中國臨床保健雜志,2013;16(2):136-8.

9姚建平,金國琴,戴薇薇,等.右歸丸對衰老大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能變化的影響〔J〕.中藥藥理與臨床,2010;26(1):8-10.

10Lueken U,Leisse M,Mattes K,etal.Altered tonic and phasic cortisol secretion following unilateral stroke〔J〕.Psychoneuroendocrinology,2009;34(3):402-12.

〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.026

北京中醫(yī)藥大學校級課題資金資助(2011-JDJS-04)；北京中醫(yī)藥大學創(chuàng)新團隊項目(2011-CXTD-22)

高穎(1963-)，女，主任醫(yī)師，教授，醫(yī)學博士，博士生導師，博士后指導教授，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治研究。

吳相春(1973-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學博士，在站博士后，主要從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治研究。

R331

A

1005-9202(2016)14-3411-03；