黃佳佳　張官嫦　譚　娜　楊曉榮　張?zhí)K園　姚　晉　鄭　洪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州　遵義　563003)

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miRNA-206 靶向細(xì)胞周期蛋白D2調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

黃佳佳張官嫦1譚娜楊曉榮張?zhí)K園姚晉鄭洪

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，貴州遵義563003)

目的探討miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。方法采用熒光定量PCR方法檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中miRNA-206 的表達(dá)情況；通過(guò)四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miRNA-206對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G增殖的影響；生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA-206可能的靶基因，并采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證預(yù)測(cè)的細(xì)胞周期蛋白D2(CCND2)是miRNA-206的靶基因；蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)miRNA-206對(duì)CCND2表達(dá)的影響。結(jié)果miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，且神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性度越高，miRNA-206的表達(dá)越低(P<0.01)；同時(shí)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miRNA-206的表達(dá)亦顯著降低(P<0.01)；轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics上調(diào)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中miRNA-206表達(dá)后可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G的增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-206可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G的增殖能力(P<0.01)。通過(guò)TargetScan軟件進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示CCND2為miRNA-206的功能性靶基因，且得到熒光素報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miRNA-206可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中CCND2的表達(dá)。結(jié)論miRNA-206可通過(guò)調(diào)節(jié)CCND2的表達(dá)，進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G的增殖能力，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中miRNA-206的低表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

miRNA-206；神經(jīng)膠質(zhì)瘤；細(xì)胞周期蛋白D2

miRNA-206在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)，且與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1,2〕。然而，關(guān)于miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)及其與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系目前還很少有文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探討miRNA-206對(duì)細(xì)胞周期蛋白D2(CCND2)蛋白表達(dá)水平的影響及其調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展的作用及相關(guān)機(jī)制。

1　材料與方法

1.1臨床資料收集2012年1月至2014年1月于我院進(jìn)行神經(jīng)膠質(zhì)瘤切除術(shù)的腫瘤及癌旁標(biāo)本50例，均經(jīng)病理證實(shí)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤。年齡33～70〔平均(48.78±14.48)〕歲。根據(jù)WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理分級(jí)。獲取標(biāo)本后迅速保存于液氮中。所有患者術(shù)前均未接受化療和放療。

1.2神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系A(chǔ)172、U87MG、T98G、293ET和PC-3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并置于37℃、5%CO2及飽和濕度的CO2孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.3主要試劑胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000、TRIzol、miRNA-206 mimics、陰性對(duì)照(NC)、anti-miRNA-NC和anti-miRNA-206購(gòu)自Invitrogen公司，SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；CCND2抗體購(gòu)自Abcam公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司。

1.4Trizol法的熒光定量PCR提取神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 1 min 50 s，共30個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-206上游引物：5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，下游引物：5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'；內(nèi)參對(duì)照U6上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3',下游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。通過(guò)CT值法對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并長(zhǎng)至70%融合時(shí)開(kāi)始進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格按照Lipofectamine2000試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的相關(guān)操作，并在轉(zhuǎn)染48 h后用于功能實(shí)驗(yàn)。

1.6四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)增殖實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔中加入20 μl的MTT溶液，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下作用4 h后吸出上清，加入150 μl的二甲基亞砜(DMSO)溶液，低速震蕩混勻10 min后，波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定OD值。

1.7生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)miRNA-206靶基因通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)軟件TargetScans篩選出CCND2作為miRNA-206的靶基因。

1.8熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證靶基因Targetscan靶基因預(yù)測(cè)軟件檢測(cè)結(jié)果提示CCND2 mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的1177-1183位點(diǎn)是miRNA-206的可能結(jié)合位點(diǎn)(BS)，體外合成含該位點(diǎn)的DNA片段及含該位點(diǎn)突變體的 DNA片段，克隆至雙熒光素酶啟動(dòng)子載體pMIR，并共同轉(zhuǎn)染至肺癌細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，采用熒光素酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.9Western印跡具體操作方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道〔3〕。至少重復(fù)3次所有實(shí)驗(yàn)。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)較正常對(duì)照組織顯著降低(P<0.01)，且神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性度越高，miRNA-206的表達(dá)越低(P<0.01)；miRNA-206在5種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)亦顯著降低(P<0.01)。

2.2miRNA-206對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG增殖的影響轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染anti-miRNA-206可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG的增殖能力(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

2.3TargetScan預(yù)測(cè)miRNA-206靶基因通過(guò)CCND2可能為miRNA-206的功能性靶基因。miRNA-206預(yù)測(cè)結(jié)合CCND2 3'-UTR的靶位點(diǎn)如圖2所示。為確定miRNA-206是否和CCND2存在直接的相互作用，構(gòu)建含野生型和突變型CCND2的3'-UTR序列的pMIR載體。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染突變型pMIR-CCND2 3'-UTR載體和miRNA-206的熒光素酶活性未出現(xiàn)顯著降低。

2.4miRNA-206對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中CCND2表達(dá)的影響轉(zhuǎn)染miRNA-206 mimics可顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG中CCND2的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染miRNA-206抑制劑可增加神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG中CCND2的表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖1　miRNA-206對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G增殖影響檢測(cè)

圖2　TargetScans靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miRNA-206靶基因

圖3　miRNA-206對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞T98G中CCND2表達(dá)影響檢測(cè)

3　討　論

miRNA作為一類(lèi)非編碼小的RNAs，其長(zhǎng)度約為19～25個(gè)核苷酸。近年來(lái)的相關(guān)文獻(xiàn)研究的結(jié)果均證實(shí)miRNA對(duì)人類(lèi)癌癥的進(jìn)展具有十分重要的作用〔3,4〕。Yunqiao等〔5〕證實(shí)miRNA-206在肝癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)均顯著降低，過(guò)表達(dá)miRNA-206可抑制胃癌細(xì)胞系的增殖，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞系的凋亡；Chen等〔6〕研究結(jié)果同樣證實(shí)miRNA-206具有抑制子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。然而關(guān)于miRNA-206在神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的作用及相關(guān)機(jī)制尚未研究清楚。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致。

miRNAs發(fā)揮作用主要通過(guò)下游的靶基因。G1細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(CDK)復(fù)合物與哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控密切相關(guān)〔7〕，其過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。因此，在多種癌癥中均存在CCND2水平的升高〔8,9〕，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果提示可能是CCND2的表達(dá)被miRNA-206所調(diào)節(jié)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力?？傊甿iRNA-206通過(guò)調(diào)控CCND2進(jìn)而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖能力。此外，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療中，miRNA-206可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)。

1Zhou J,Tian Y,Li J,etal.miR-206 is down-regulated in breast cancer and inhibits cell proliferation through the up-regulation of cyclinD2〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;433(2):207-12.

2Zhang L,Liu X,Jin H,etal.miR-206 inhibits gastric cancer proliferation in part by repressing cyclinD2〔J〕.Cancer Lett,2013;332(1):94-101.

3Zhang Y,Zheng D,Xiong Y,etal.miR-202 suppresses cell proliferation in human hepatocellular carcinoma by downregulating LRP6 post-transcriptionally〔J〕.FEBS Lett,2014;588(10):1913-20.

4Hong L,Han Y,Yang J,etal.MicroRNAs in gastrointestinal cancer:prognostic significance and potential role in chemoresistance〔J〕.Expert Opin Biol Ther,2014;14(8):1103-11.

5Yunqiao L,Vanke H,Jun X,etal.MicroRNA-206,down-regulated in hepatocellular carcinoma,suppresses cell proliferation and promotes apoptosis〔J〕.Hepato-gastroenterol,2014;61(133):1302-7.

6Chen X,Yan Q,Li S,etal.Expression of the tumor suppressor miR-206 is associated with cellular proliferative inhibition and impairs invasion in ERα-positive endometrioid adenocarcinoma〔J〕.Cancer Lett,2012;314(1):41-53.

7Kshaunis M,Subhabrata P,Rita K.Induction of apoptosis in G1/S blocked hela cells by r-roscovitine:a preliminary study〔J〕.Proceed Zoolog Soc,2014;67(2):114-25.

8Mermelshtein A,Gerson A,Walfisch S,etal.Expression of D-type cyclins in colon cancer and in cell lines from colon carcinomas〔J〕.Br J Cancer,2005;93(3):338-45.

9Dong Q,Meng P,Wang T,etal.MicroRNA let-7a inhibits proliferation of human prostate cancer cells in vitro and in vivo by targeting E2F2 and CCND2〔J〕.PLoS One,2010;5(4):e10147.

〔2015-12-27修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.025

黃佳佳(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事分子病理研究。

R730.264

A

1005-9202(2016)14-3409-02；

1茅臺(tái)集團(tuán)職工醫(yī)院