趙　方　銀　瑞

(鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院麻醉科，河南　南陽　473000)

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舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響

趙方銀瑞1

(鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院麻醉科，河南南陽473000)

目的研究不同濃度舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡和分化的影響。方法從孕14 d的Wistar大鼠中分離胚胎神經(jīng)干細胞并培養(yǎng)，采用神經(jīng)干細胞標記蛋白Nestin免疫熒光染色對胚胎神經(jīng)干細胞進行鑒定；BrdU滲入法檢測不同濃度舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響；采用流式細胞儀檢測不同濃度舒芬太尼對胚胎干細胞凋亡的影響；NeuN/DAPI、GFAP/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞和星形膠質細胞以檢測不同濃度蘇芬太尼對胚胎干細胞分化的影響。結果從孕14 d的Wistar大鼠中分離得到大鼠胚胎神經(jīng)干細胞，經(jīng)過不同濃度的舒芬太尼處理后，發(fā)現(xiàn)低濃度(0.5 nmol/L)的舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化沒有明顯影響，而隨著劑量增大至中濃度(5 nmol/L)時可以引起細胞的凋亡和分化，增加至高濃度(50 nmol/L)時可以抑制胚胎神經(jīng)干細胞的增殖。結論高劑量的舒芬太尼可能通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

舒芬太尼；神經(jīng)干細胞；胚胎神經(jīng)干細胞；增殖；凋亡；分化

在所有阿片類制劑中，舒芬太尼的鎮(zhèn)痛效果最強〔1〕，但是，目前舒芬太尼對神經(jīng)干細胞的影響尚未見報道。神經(jīng)干細胞具有多向分化的潛能，還具有很強的跨系或跨胚層分化潛能，能夠轉化為造血細胞并重建造血系統(tǒng)，還能夠分化為肌細胞。因此，神經(jīng)干細胞也被稱為神經(jīng)多潛能干細胞〔2～5〕。另外，神經(jīng)干細胞具有自我維持和更新能力，通過對稱分裂和不對稱分裂，能夠在某一確定部位維持穩(wěn)定的數(shù)量，并在必要時進行增殖〔6〕。本研究旨在研究不同濃度舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響。

1　材料和方法

1.1材料實驗于2014年6月至2015年8月在鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院病理實驗室完成。舒芬太尼(枸櫞酸舒芬太尼注射液)購買自宜昌人福藥業(yè)有限公司，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成母液(100 nmol/L)，-20℃的冰箱保存?zhèn)溆谩istar大鼠20只購自中國科學院上海實驗動物中心。分為對照組(等體積PBS緩沖液)，低濃度組(0.5 nmol/L)，中濃度組(5 nmol/L)及高濃度組(50 nmol/L)。BrdU(美國Sigma-Aldrich)，DMEM/F12細胞培養(yǎng)液(美國Hyclone)，B27添加劑、N2添加劑、BFGF、EGF(美國Sigma-Aldrich)，Nestin單克隆抗體、NeuN單克隆抗體、GFAP單克隆抗體、BrdU單克隆抗體(美國Chemicon)，F(xiàn)ITC熒光標記二抗(北京中杉公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，流式細胞儀(美國BD公司)，免疫熒光分析儀(美國perkin Elmer)。

1.2方法

1.2.1胚胎神經(jīng)干細胞的分離及培養(yǎng)將孕14 d的Wistar大鼠頸椎脫臼處死，常規(guī)分離出胚胎大腦，PBS沖洗，無菌條件下去除頭皮及腦膜，分離出腦組織。將分離出的腦組織剪切成細小組織塊，胰蛋白酶消化，吹打，過濾后，離心。細胞沉淀用無血清培養(yǎng)液(DMEM/F12 1∶1)洗滌2次，加入神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液〔DMEM/F12，含2%B27，1% N2添加劑，20 ng/ml表皮生長因子(EGF)，20 ng/ml堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，青霉素200 U/L及鏈霉素100 U/L，pH7.4〕。將細胞吹打成單細胞懸液后，臺盼藍染色進行細胞計數(shù)，培養(yǎng)瓶中接種密度為4×109/L。原代克隆形成后，6～9 d克隆傳代1次，每2～3 d半量換液，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱。

1.2.2胚胎神經(jīng)干細胞鑒定取傳代2次的細胞懸液滴入多聚賴氨酸包被的玻片上，待細胞貼壁后，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS清洗3次，加入0.25%的Triton-100孵育5 min，再以山羊血清封閉30 min。封閉結束后，加入抗Nestin單克隆抗體4℃過夜，PBS清洗3次后，加入異硫氰基熒光素(FITC)標記的二抗，室溫孵育60 min，PBS清洗3次，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3細胞增殖檢測將細胞以5×104個/孔接種于多聚賴氨酸包被過得48孔板中。待細胞貼壁后，藥物處理組加入舒芬太尼，使終濃度為0.5、5、50 nmol/L，對照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔5 μmol/L BrdU，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，PBS清洗后95%乙醇固定30 min，BrdU和4′-6-二脒基-二苯基吲哚(DAPI)雙染，熒光顯微鏡下觀察，記錄陽性細胞數(shù)。

1.2.4細胞凋亡檢測取傳代2次的神經(jīng)干細胞球，吹打成單細胞懸液，并將計數(shù)后的細胞懸液加入6孔板中，每孔約5×105個。待細胞完全貼壁后，加入舒芬太尼，使終濃度為0.5、5、50 nmol/L，對照組加入等體積的PBS，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。孵育完成后，胰蛋白酶消化并收集每孔的細胞，預冷的PBS清洗3次。70%的乙醇固定，4℃過夜，離心棄去固定液，PBS清洗2次，再用Binding Buffer重懸，每孔加入各5 μl的Annexin V-FITC和PI，室溫避光反應后，流式細胞儀進行分析，計算細胞凋亡率。

1.2.5胚胎神經(jīng)干細胞分化檢測將傳代2～3次生長良好的神經(jīng)球吹打成單細胞懸液，以1×105/孔的密度接種于多聚賴氨酸包被過的48孔板中，待細胞貼壁后，更換培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液，并在培養(yǎng)液中加入工作濃度為0.5、5、50 nmol/L的舒芬太尼，空白對照加入等體積的PBS緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，更換培養(yǎng)液為不含藥物的干細胞培養(yǎng)液，72 h后固定細胞，分別進行NeuN/DAPI、GFAP/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞和星形膠質細胞，觀察細胞并計數(shù)。

1.3主要觀察指標大鼠胚胎神經(jīng)干細胞的分離及鑒定，不同濃度的舒芬太尼對大鼠胚胎神經(jīng)干細胞增殖、凋亡及分化的影響。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS14.0軟件進行t檢驗或單因素方差分析。

2　結　果

2.1大鼠胚胎神經(jīng)干細胞分離培養(yǎng)及鑒定結果在分離出的胚胎干細胞原代培養(yǎng)2～3 d后可見由單個細胞形成的神經(jīng)球或數(shù)個細胞聚集形成的神經(jīng)球懸浮于培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)5～7 d后可見懸浮的神經(jīng)球數(shù)目明顯增多，經(jīng)過幾代培養(yǎng)后，只有具備自我更新能力的神經(jīng)干細胞能夠存活并增殖成懸浮生長的神經(jīng)干細胞球。利用Nestin免疫熒光染色觀察結果顯示，神經(jīng)干細胞增殖形成的細胞團有顯著的熒光這色現(xiàn)象，證明了神經(jīng)干細胞呈現(xiàn)Nestin陽性，神經(jīng)球主要是由神經(jīng)干細胞組成的。見圖1。

圖1　Nestin免疫熒光染色結果(×100)

2.2舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞增殖的影響對照組的陽性細胞比例為(45.68±6.98)%，舒芬太尼低濃度劑量組為(42.95±3.96)%，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；中濃度劑量組為(39.95±4.56)%，與對照組相比無顯著性差異(P>0.05)；高濃度劑量組為(32.26±3.25)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞凋亡的影響不同濃度的舒芬太尼處理大鼠胚胎干細胞48 h后，對照組細胞的凋亡率為(21.92.26±2.98)%，低濃度處理組為(24.56±2.59)%，與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；中濃度處理組為(31.65±3.36)%，與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；高濃度組為(38.86±4.26)%，與對照組相比，差異極顯著(P<0.01)。

2.4舒芬太尼對胚胎神經(jīng)干細胞分化的影響使用NeuN/DAPI、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)/DAPI雙染標記神經(jīng)元細胞及星形膠質細胞，熒光顯微鏡觀察結果顯示，對照組中神經(jīng)元細胞的比例為(15.16±1.87)%，星形膠質細胞的比例為(14.89±1.68)%；舒芬太尼低劑量組分別為(18.59±1.36)%，(16.20±1.68)%，與對照組相比無顯著差異(P>0.05)；中劑量組分別為(21.56±3.69)%，(25.56±2.45)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；高劑量組分別為(26.23±2.35)%和(28.26±2.65)%，與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

3　討　論

隨著對舒芬太尼研究的不斷深入，其應用范圍也在不斷地擴大。楊金鳳等〔7〕報道，舒芬太尼在臨床常用劑量范圍內(nèi)對肝癌細胞的增殖和凋亡無明顯影響，但隨著濃度的增加，舒芬太尼可以抑制肝癌細胞的增殖、誘導細胞的凋亡、并將細胞周期阻滯在G1期。高巍等〔8〕報道，不同濃度的舒芬太尼處理肝癌(Hep3B)細胞可以降低細胞活性、使細胞周期阻滯在G0/G1期，誘導細胞凋亡、降低survivin蛋白的表達量，提高(caspase-3)蛋白的表達量。還有研究顯示，不同濃度的舒芬太尼可以抑制H9C2細胞缺氧復氧后損傷，提高細胞的活力，說明舒芬太尼可以濃度依賴性的增強細胞抗缺氧復氧損傷能力〔9〕。

神經(jīng)干細胞的分離主要是利用培養(yǎng)基篩選出能夠在該條件下存活并增殖的神經(jīng)干細胞群(神經(jīng)球)，而成熟的神經(jīng)細胞則無法較長時間的存活。首先將神經(jīng)組織通過機械方法制備成單細胞并培養(yǎng)與含有特殊營養(yǎng)添加劑和促增殖因子的無血清培養(yǎng)基中，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，即可獲得呈神經(jīng)球狀生長的神經(jīng)干細胞群體〔10〕。本實驗神經(jīng)干細胞呈神經(jīng)球狀生長，將神經(jīng)球吹打分散成單細胞后，單個細胞即可增殖成神經(jīng)球，也可由數(shù)個細胞聚集形成小神經(jīng)球結構，這種小的神經(jīng)球再增殖成較大的神經(jīng)球。

BrdU是胸腺嘧啶核苷類似物，可以取代可代替胸腺嘧啶核苷插入正在復制的DNA雙鏈中并進入子代細胞中，通過檢測DNA中BrdU的含量來特異性的顯示增殖狀態(tài)的細胞，實驗動物體內(nèi)無內(nèi)源性的BrdU存在〔11〕。本研究提示高劑量的舒芬太尼可能干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖，從而對神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響。

Bovill等〔12〕報道，臨床上有效靶控舒芬太尼的低、中劑量濃度為0.4～0.8 ng/ml，大劑量濃度為4～6 ng/ml，可單位換算為0.01～0.016 μmol/L。本研究結果提示，高劑量的舒芬太尼可能通過影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中神經(jīng)干細胞的增殖、凋亡和分化，進而影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

1Hakkim A，Kirubahar R，Kanna V，etal.Comparative study of 0.5% hyperbaric bupivacaine with sufentanil(5 μg)and 0.5% hyperbaric bupivacaine for spinal anesthesia〔J〕.Int J,2015；20151193.

2Song J，Zhong C，Bonaguidi MA，etal.Neuronal circuitry mechanism regulating adult quiescent neural stem-cell fate decision〔J〕.Nature,2012；489：150-4.

3Streckfuss-B?meke K，Wolf F，Azizian A，etal.Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells，hair keratinocytes，and skin fibroblasts〔J〕.Eur Heart J,2013；34(33)：2618-29.

4Azim K，F(xiàn)ischer B，Hurtado-Chong A，etal.Persistent wnt/β-catenin signaling determines dorsalization of the postnatal subventricular zone and neural stem cell specification into oligodendrocytes and glutamatergic neurons〔J〕.Stem Cells,2014；32(5)：1301-12.

5Jiang Y，Habibollah S，Tilgner K，etal.An induced pluripotent stem cell model of hypoplastic left heart syndrome(HLHS)reveals multiple expression and functional differences in hlhs-derived cardiac myocytes〔J〕.Stem Cells Transl Med,2014；3(4)：416-23.

6Azevedo-Pereira RL，Daadi MM.Isolation and purification of self-renewable human neural stem cells for cell therapy in experimental model of ischemic stroke〔J〕.Methods Mol Biol,2013;1059：157-67.

7楊金鳳，孫瑛瑋，孫輝平，等.舒芬太尼對體外培養(yǎng)hepg2細胞增殖及細胞凋亡的影響〔J〕.腫瘤藥學，2011；1(2)：121-4.

8高巍，張曉琪，景桂霞，等.舒芬太尼抑制肝癌HepGb細胞活性及促進凋亡作用〔J〕.西安交通大學學報：醫(yī)學版，2015；36(3)：479-82.

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11Duque A，Rakic P.Identification of proliferating and migrating cells by brdu and other thymidine analogs：benefits and limitations〔J〕.Immunocytochem Relat Techniq，2015;(101)：123-39.

12Bovill JG，Sebel PS，Blackburn CL，etal.The pharmacokinetics of sufentanil in surgical patients〔J〕.Anesthesiology,1984；61(5)：502-6.

〔2015-10-26修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.022

趙方(1981-)，女，主治醫(yī)師，主要從事麻醉學基礎研究。

R614

A

1005-9202(2016)14-3402-03；

1鄭州大學附屬南陽中心醫(yī)院胸外科