陳　巍

(?？谑袐D幼保健院婦產(chǎn)科，海南　?？凇?70203)

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胰島素樣生長因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β1在來曲唑誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征模型大鼠中的表達(dá)及意義

陳巍

(?？谑袐D幼保健院婦產(chǎn)科，海南?？?70203)

目的研究胰島素樣生長因子(IGF)-1和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1在來曲唑誘導(dǎo)多囊卵巢綜合征(PCOS)模型大鼠中的表達(dá)及意義。方法將46只SD雌性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組和實驗組各23只。實驗組應(yīng)用來曲唑(1 mg·kg-1·d-1)灌胃制備PCOS模型，對照組灌胃等量的羧甲基纖維素，兩組均灌胃21 d。每日采集陰道涂片觀察大鼠動情周期變化，21 d后收集大鼠血清及卵巢組織切片，采用放射免疫法測定血清中的性激素水平，顯微鏡下觀察卵巢組織的病理組織學(xué)改變，應(yīng)用免疫組化法測定切片中IGF-1和TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果實驗組大鼠灌胃12 d時即失去動情周期變化，卵巢組織病理學(xué)顯示呈PCOS相關(guān)改變。實驗組大鼠血清促黃體生成素(LH)、孕酮(P)水平顯著高于對照組(P<0.05)，而兩組促卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、睪酮(T)水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。實驗組IGF-1在兩組卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中的表達(dá)高于對照組(P<0.05)；TGF-β1在卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，且實驗組卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)強于對照組(P<0.05)，而在其他細(xì)胞中的表達(dá)(P>0.05)。結(jié)論來曲唑誘導(dǎo)的PCOS模型大鼠與人類PCOS特征相似，而IGF-1、TGF-β1在PCOS大鼠模型中呈高表達(dá)，兩種指標(biāo)的檢測對人類PCOS的診斷及發(fā)病機(jī)制研究具有重要參考價值。

多囊卵巢綜合征；胰島素樣生長因子Ⅰ；轉(zhuǎn)化生長因子β1

多囊卵巢綜合征(PCOS)發(fā)病率約6%～12%〔1〕。目前其發(fā)病原因尚不十分明確，普遍認(rèn)為高雄激素血癥及胰島素抵抗是其發(fā)生的關(guān)鍵因素。胰島素樣生長因子(IGF)-1與轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1作為卵巢內(nèi)產(chǎn)生的生長因子，在細(xì)胞生長、分化、凋亡和血管生成等方面發(fā)揮多種生物學(xué)作用，也在PCOS的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。有研究表明，IGF-1和TGF-β1水平異常，將對卵巢組織內(nèi)卵泡發(fā)育和正常細(xì)胞的轉(zhuǎn)化等造成影響〔2〕，引起體內(nèi)內(nèi)分泌失調(diào)。本研究旨在探索二者在PCOS形成過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選取6周齡清潔級雌性SD大鼠46只(由海南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供)，體重100～150 g，均表現(xiàn)4 d的規(guī)律動情周期。于動物實驗室自由進(jìn)食喂養(yǎng)，室溫(22.0±3.0)℃，濕度50%～75%，自然光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.1.2主要試劑與儀器來曲唑片(江蘇恒瑞制藥廠)，放射免疫法(RIA)藥盒(天津中新科炬生物制藥有限公司)，免疫組織化學(xué)試劑盒、IGF-1和TGF-β1試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，切片機(jī)(金華華速科技有限公司)，光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS)，圖像分析系統(tǒng)(上海山富科學(xué)儀器有限公司)

1.2實驗方法

1.2.1動物分組與模型制備采用隨機(jī)數(shù)字表法將46只大鼠隨機(jī)分為實驗組與對照組各23只。實驗組大鼠通過灌胃來曲唑1 mg·kg-1·d-1(預(yù)先溶于體積分?jǐn)?shù)1%的羧甲基纖維素中)建立PCOS模型。對照組每日灌胃等量的羧甲基纖維素，兩組均持續(xù)灌胃21 d。

1.2.2標(biāo)本采集實驗組造模成功大鼠最后一次灌胃12 h后，禁食12 h，行10%水合氯醛麻醉，對照組于最后一次動情間期麻醉。處死大鼠，經(jīng)心臟放血收集血液5 ml，2 000 r/min離心20 min取血清，-40℃凍存待用。摘取大鼠雙側(cè)卵巢組織，經(jīng)修剪、稱重后，迅速投入10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，經(jīng)烤片、脫水、蘇木精-伊紅染色、脫水、封固等處理后保存。部分切片行病理組織學(xué)觀察，另一部分進(jìn)行免疫組織化學(xué)測定。

1.3觀察指標(biāo)

1.3.1動情周期監(jiān)測灌胃期間每日進(jìn)行陰道涂片以監(jiān)測大鼠動情周期的變化，顯微鏡下大鼠動情周期判斷標(biāo)準(zhǔn)；(1)動情前期：全部顯示為有核上皮細(xì)胞，偶有少量角化細(xì)胞；(2)動情期：全部為無核角化細(xì)胞或有少量上皮細(xì)胞；(3)動情后期：可見白細(xì)胞、角化細(xì)胞、有核上皮細(xì)胞；(4)動情間期：可見大量白細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞或黏膜。

1.3.2卵巢病理組織學(xué)檢查。

1.3.3血清性激素采用放射免疫法(RIA)藥盒測定血清中的促黃體生成素(LH)、促卵泡刺激素(FSH)、雌二醇(E2)、孕酮(P)及睪酮(T)水平，確定大鼠體內(nèi)內(nèi)分泌的改變。

1.3.4卵巢組織中IGF-1和TGF-β1的表達(dá)取卵巢組織切片，采用免疫組織化學(xué)非生物二步法試劑盒進(jìn)行組織染色，具體包括脫蠟、梯度酒精水化、抗原修復(fù)、一抗孵育、二抗孵育、顯色、脫水、透明、封片等。分別采用IGF-1和TGF-β1試劑盒檢測卵巢組織中IGF-1和TGF-β1的表達(dá)情況。所有操作過程嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對照。每張切片隨機(jī)觀察5個高倍鏡視野，在圖像分析系統(tǒng)下進(jìn)行圖像灰度值分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS14.0軟件進(jìn)行t檢驗。

2　結(jié)　果

2.1兩組大鼠動情周期變化實驗組大鼠于灌胃12 d后失去動情周期的規(guī)律性變化，均顯示為動情間期時相，提示大鼠無排卵。對照組動情周期正常。

2.2兩組大鼠卵巢質(zhì)量及組織病理學(xué)改變實驗組大鼠卵巢質(zhì)量為(32.54±6.71)mg/100 g體質(zhì)量，對照組大鼠為(25.16±5.94)mg/100 g體質(zhì)量，兩組比較差異顯著(t=10.430，P<0.05)。顯微鏡下卵巢切片組織病理學(xué)觀察可見：對照組卵巢呈現(xiàn)不同發(fā)育階段的卵泡及黃體，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞多為6～8層；實驗組中卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞缺失，初級卵泡、囊狀擴(kuò)張的卵泡和閉鎖卵泡增多，顆粒細(xì)胞層減少至2～3層，卵泡膜增厚，間質(zhì)細(xì)胞增生。

2.3兩組大鼠血清性激素水平比較灌胃處理21 d后，實驗組大鼠血清中的LH、P水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而兩組FSH、E2、T水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1　兩組大鼠血清性激素水平比較±s，n=23)

2.4兩組大鼠卵巢組織中IGF-1、TGF-β1的表達(dá)免疫組化法結(jié)果顯示，IGF-1主要表達(dá)于卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中，且實驗組的表達(dá)高于對照組(P<0.05)；TGF-β1在卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)，在實驗組卵泡膜細(xì)胞中的表達(dá)強于對照組(P<0.05)，而在其他細(xì)胞中的表達(dá)兩組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、表3。

表2　兩組大鼠卵巢組織中IGF-1的表達(dá)

表3　兩組大鼠卵巢組織中TGF-β1的表達(dá)

3　討　論

PCOS是婦科常見的內(nèi)分泌異常和代謝異常所致的排卵功能障礙性疾病，臨床主要表現(xiàn)為肥胖、多毛、閉經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)等，患者由于肥胖癥、雄激素升高及胰島素抵抗等多種因素導(dǎo)致患2型糖尿病、心血管疾病、高雄激素血癥等病的風(fēng)險大大增加〔3〕，該病具有反復(fù)性、難治性、終身性的特點，對患者的生理與心理健康造成嚴(yán)重危害〔4〕。PCOS的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，不同領(lǐng)域的學(xué)者們從不同角度進(jìn)行了大量研究，中醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PCOS的發(fā)生與患者痰濕質(zhì)、氣郁質(zhì)體質(zhì)有關(guān)〔5〕；也有研究對PCOS的易感基因進(jìn)行研究，指出有包括與胰島素調(diào)節(jié)、性激素調(diào)節(jié)和心血管風(fēng)險相關(guān)的共37個基因與PCOS的發(fā)生有關(guān)〔6〕。而目前普遍認(rèn)同的觀點是，高雄激素血癥、高胰島素血癥及胰島素抵抗是引發(fā)PCOS的主要病因。

IGF-1是一類在結(jié)構(gòu)和功能上與胰島素有較高同源性的多肽生長因子，在促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化及血管形成等方面發(fā)揮重要作用。TGF-β1是細(xì)胞自分泌和旁分泌的細(xì)胞內(nèi)源性生長抑制因子，在控制細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用。IGF-1和TGF-β1均可由卵巢合成，在生殖細(xì)胞的存活與凋亡中起重要的調(diào)控作用，其表達(dá)異?？赡軙鹇雅莸纳L和發(fā)育障礙，造成體內(nèi)內(nèi)分泌功能紊亂。有研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1和TGF-β1表達(dá)異常與卵巢疾病的發(fā)生有關(guān)〔7,8〕。

本研究說明來曲唑灌胃能成功建立大鼠PCOS模型。此外，本研究還提示IGF-1對PCOS的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用，其作用機(jī)制可能是：(1)IGF-1與胰島素具有較高的同源性，在分子結(jié)構(gòu)、受體及功能上發(fā)生相互重疊〔9〕，在卵巢功能中形成一整套完善的調(diào)節(jié)系統(tǒng)〔10〕。卵巢在胰島素和IGF-1的過度刺激下，對卵泡生成素、黃體生成素敏感性顯著增加，使初級卵泡增加，卵泡發(fā)育減慢甚至停止，而原始卵泡在其刺激下不斷啟動發(fā)育，造成多囊卵巢的形成；(2)IGF-1可協(xié)同LH，促進(jìn)雄激素的合成和分泌〔11〕，IGF-1還能協(xié)同胰島素進(jìn)一步抑制肝臟，造成游離睪酮水平的升高；(3)IGF-1參與的卵巢血管生成異常也是造成PCOS等多種病變的重要原因〔12〕。

本研究與以往研究結(jié)果相符〔13〕，其原因可能為：TGF-β1可誘導(dǎo)發(fā)揮血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)發(fā)揮作用，促進(jìn)血管生成，引起多囊卵巢間質(zhì)纖維化和包膜增厚，阻礙卵泡的發(fā)育〔14〕，同時，其對卵泡膜細(xì)胞的增殖、分化和FSH受體的形成也有重要影響。此外，TGF-β1還可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成和沉積，影響生殖細(xì)胞的周期性變化〔15〕。

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〔2015-10-23修回〕

(編輯滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.019

陳巍(1979-)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦科內(nèi)分泌研究。

R711.75

A

1005-9202(2016)14-3395-03；