魏艷霞

(南陽市中心醫(yī)院，河南　南陽　473003)

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慢性應(yīng)激和組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響及其作用機制

魏艷霞

(南陽市中心醫(yī)院，河南南陽473003)

目的觀察慢性應(yīng)激和組蛋白去乙?；敢种苿┒∷徕c對大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力的影響及其作用機制。方法將58只雄性SD大鼠隨機地分為對照+生理鹽水組、對照+丁酸鈉組、慢性應(yīng)激+生理鹽水組及慢性應(yīng)激+丁酸鈉組。慢性應(yīng)激組給予連續(xù)21 d制動應(yīng)激，應(yīng)激結(jié)束后將每組大鼠隨機選出8只采用Y迷宮及Morris水迷宮檢測空間學(xué)習(xí)、記憶能力，余下大鼠采用 蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)檢測海馬組蛋白H3、H4乙?；头磻?yīng)元件結(jié)合蛋白(p-CREB)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的表達變化。結(jié)果慢性制動應(yīng)激的大鼠較未應(yīng)激大鼠體重增長緩慢(P<0.01)。在Y迷宮測試中，各組大鼠進入各個臂次數(shù)百分比差異無統(tǒng)計學(xué)(P>0.05)；各組大鼠在三個臂的停留時間百分比的分析，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，而組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，對照+生理鹽水組、對照+丁酸鈉組和慢性應(yīng)激+丁酸鈉組在新異臂的停留時間遠多于其他兩臂(P<0.05)；此外，單因素方差分析顯示慢性應(yīng)激+生理鹽水組在各個臂的總穿越次數(shù)較對照+生理鹽水組多明顯減少(P<0.05)。水迷宮定位導(dǎo)航試驗實驗顯示，各組大鼠平均潛伏期組內(nèi)、組間均差異顯著；定位導(dǎo)航試驗第2天，對照+丁酸鈉組平均潛伏期較對照+生理鹽水組有明顯增高(P<0.05)；而慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠在訓(xùn)練第3天的平均潛伏期顯著高于對照+生理鹽水組，同時慢性應(yīng)激+丁酸鈉組找尋找平臺的時間也明顯低于慢性應(yīng)激+生理鹽水組(P<0.05)。水迷宮空間探索試驗中，大鼠在目標象限游泳時間、距離百分比及穿越平臺區(qū)域的次數(shù)均無顯著差異(P>0.05)；而對大鼠在目標象限及目標相反象限的游泳時間進行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)有顯著差異(P<0.01)，而組間差異不明顯(P>0.05)；慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠在兩個區(qū)域的游泳時間無明顯差異，而其余三組大鼠在目標象限的游泳時間均顯著高于其在目標相反象限的時間(P<0.01)。WB結(jié)果提示慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠acH3蛋白含量的低于對照+生理鹽水組(P<0.05)，而acH4蛋白含量雖有降低趨勢，卻無統(tǒng)計學(xué)差異；慢性應(yīng)激+丁酸鈉組與慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠相比較，acH3、acH4蛋白水平均明顯增加(P<0.01)。慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠海馬p-CREB水平明顯低于對照+生理鹽水組(P<0.01)，其BDNF含量也同樣低于對照+生理鹽水組(P<0.05)；慢性應(yīng)激+丁酸鈉組與慢性應(yīng)激+生理鹽水組大鼠相比p-CREB、BDNF含量均有明顯增加(P<0.01、P<0.05)；對照+丁酸鈉組組大鼠相對于對照+生理鹽水組BDNF含量有所減少(P<0.05)，而p-CREB含量則無明顯變化。結(jié)論慢性應(yīng)激可減緩大鼠體重增長，損害其空間學(xué)習(xí)和記憶水平，而丁酸鈉可以對應(yīng)激大鼠的學(xué)習(xí)記憶起保護作用，其可能是通過影響海馬組蛋白乙?；罢J知相關(guān)蛋白表達而實現(xiàn)。

慢性應(yīng)激；丁酸鈉；空間學(xué)習(xí)記憶

多種神經(jīng)遞質(zhì)及認知相關(guān)蛋白表達的改變參與了慢性應(yīng)激所致認知損害進程〔1～3〕。丁酸鈉作用于離體的大鼠腦片時可顯著增加慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型大鼠海馬區(qū)域的組蛋白乙?；?，尤其是H4 的乙?；捷^給予丁酸鈉的正常大鼠的腦片有顯著增加〔4〕。慢性應(yīng)激可能通過增強HDAC 的作用，引起大鼠海馬組蛋白乙酰化水平下降，減低認知相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致神經(jīng)突觸結(jié)構(gòu)和功能受損，出現(xiàn)認知功能損害〔5〕，因此，上調(diào)大鼠海馬組蛋白乙?；綄β詰?yīng)激大鼠認知功能損害的作用值得期待。本研究擬觀察其對大鼠海馬組蛋白乙?；郊罢J知相關(guān)分子表達的變化。

1　材料和方法

1.1材料實驗動物：本實驗選用雄性SPF 級Spraque-Dawley 大鼠56 只，體重(200±20)g，由四川大學(xué)動物實驗中心提供，動物合格證號SCXK(JII19)。大鼠飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，每籠4 只，室溫(22±2)℃，濕度50%～55%，晝夜節(jié)律12 h/12 h。大鼠可自由飲食飲水，在適應(yīng)環(huán)境1 w后開始實驗，每周稱重一次。

主要儀器和試劑：2K15高速冷凍離心機，Sigma公司；752-P紫外分光光度計，上?，F(xiàn)科儀器有限公司；PL-203電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；DYY-6C電泳儀，北京六一儀器廠；DYCZ-24D垂直電泳槽，北京六一儀器廠；DYCZ-40D電轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，北京六一儀器廠；WD-9405A脫色搖床，北京六一儀器廠；79-1磁力攪拌器，常州澳華儀器有限公司；BCD-186 冰箱，西門子；ECL Plus顯色試劑盒，安瑪西亞公司；PVDF 膜，Millipore 公司；聚丙烯酰胺，Sigma 公司；SDS，Sigma公司；Tris-base，Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)，Roche公司；蛋白marker(10～170 kD)，F(xiàn)ermentas 公司；β-actin，Santa 公司；Anti-acetyl Histone H4(Lys5/8/12/16)，Millipore 公司；Anti-acetyl Histone H3(Lys14)，Millipore 公司；Anti-phospho-CREB，Millipore 公司；Anti-BDNF，Millipore 公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1實驗分組隨機分為對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組、應(yīng)激生理鹽水組及應(yīng)激丁酸鈉組，每組各14只，各組平均體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2.2給藥方案慢性應(yīng)激組大鼠均給予21 d連續(xù)制動應(yīng)激，對照組均飼養(yǎng)于標準環(huán)境，大鼠統(tǒng)一在實施應(yīng)激前半小時給8.4 ml/100 g 生理鹽水或丁酸鈉溶液腹腔注射。腹腔注射前用碘酒消毒注射區(qū)域皮膚，每天更換注射器。本實驗生理鹽水均采用醫(yī)療注射用生理鹽水，丁酸鈉購于美國Sigma公司，避光保存，每日注射前新鮮配制，用生理鹽水配制成濃度為10%的溶液，搖勻后使用。

1.2.3慢性制動應(yīng)激模型慢性應(yīng)激裝置參照文獻〔6〕自制。由薄鐵皮制成無蓋盒子，上有可自由開合的金屬網(wǎng)蓋，盒內(nèi)平均分隔為四個長方形格子(20 cm×7.5 cm×8 cm)，每格可放一只大鼠。放入大鼠后可根據(jù)動物的大小加入合適的長條形木板，以更好的限制大鼠的活動。應(yīng)激組大鼠在標準環(huán)境中采用該裝置給予連續(xù)21 d每天6 h(10：30～16：30)的慢性制動應(yīng)激。應(yīng)激結(jié)束后徹底沖洗應(yīng)激裝置，晾干備用。

1.2.4Y迷宮測試關(guān)閉新異臂入口處的活動門，將動物由起始臂起始端放入迷宮，任其自由探索起始臂及臂15 min；結(jié)束4 h之后，打開活動門，將動物由起始臂放入迷宮，任其自由探索三個臂5 min。實驗在同樣的光線下進行，避免晝夜節(jié)律對動物活動度的影響。在每次實驗后采用酒精擦洗實驗裝置以避免氣味對動物的影響。動物放入迷宮后，測試者迅速離開，避免人為干擾。整個實驗過程由迷宮正上方的攝像頭記錄，由專業(yè)軟件分析。

1.2.5Morris水迷宮測試每天將大鼠由4 個入水點分別放入水中一次，入水點的先后順序隨機產(chǎn)生。記錄找到平臺的時間，即逃避潛伏期作為大鼠學(xué)習(xí)水平的依據(jù)。大鼠每次尋找平臺的時間設(shè)定為60 s，時間結(jié)束后用木棍引導(dǎo)尚未找到平臺的大鼠到達平臺，未找到平臺的大鼠的潛伏期記錄為60 s。所有大鼠上平臺后停留20 s，使其通過觀察周圍環(huán)境記住平臺的位置，學(xué)習(xí)結(jié)束后放回籠中。本實驗中定位導(dǎo)航試驗共進行5 d，所有訓(xùn)練在每天同一時間完成，在第7天進行空間探索試驗：撤掉水中的平臺，選擇SW 作為入水點，記錄大鼠在30 s內(nèi)的游泳軌跡，軟件可測算大鼠在四個象限游泳的速度、距離、時間等，也可記錄大鼠在之前平臺區(qū)域的穿越次數(shù)，以上數(shù)據(jù)均可表示大鼠對原來水下平臺的記憶能力。

1.2.6WB檢測在應(yīng)激結(jié)束后間隔一天，即實驗第23 d進行組織取材。采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(350 mg/kg)，大鼠對疼痛刺激無反應(yīng)后迅速斷頭，用小止血鉗小心剝離顱骨，取出腦組織置于冰上，快速分離出大鼠雙側(cè)海馬組織，分別置于標記好的凍存管后立即放入液氮中暫存，待所有組織取完后統(tǒng)一放入-80℃冰箱中保存，隨后進行WB檢測。取100 mg/ml BSA，室溫融化后用生理鹽水稀釋至1 mg/ml；取離心管，分別加入相應(yīng)試劑，混勻后，室溫放置2 min，用分光光度計比色分析，制作標準曲線；將1 μl待測蛋白加入900 μl Bradford和99 μl生理鹽水，混勻后在595 nm處檢測吸光度。根據(jù)標準曲線計算出樣本的蛋白濃度。

1.2.7SDS-PAGE電泳將兩塊清潔玻璃板對齊后放入夾中卡緊；加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。待膠充分凝固后可倒去膠上層水并用吸水紙將剩余水吸干；配5%的濃縮膠，加入TEMED后充分混合，將剩余空間灌滿，然后將梳子插入濃縮膠中，待膠凝固后垂直將梳子拔出。用去離子水沖洗后將加樣孔中液體用濾紙吸去；根據(jù)所測蛋白含量，計算含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。取蛋白標本至離心管中，加入適量蛋白上樣緩沖液。上樣前沸水浴5 min使蛋白變性；加入足量電泳液后開始電泳。濃縮膠電壓為75 V；分離膠電壓為120 V，當溴酚藍前沿電泳到分離膠底部時終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。

1.2.8免疫反應(yīng)將轉(zhuǎn)好的PVDF膜置于室溫下脫色搖床上的封閉液中，封閉1 h；用TBST 溶解的5%脫脂牛奶將一抗稀釋1 000倍，將PVDF膜蛋白朝下放于抗體液面，趕出氣泡，4℃過夜。用TBST在室溫下脫色，并在搖床上洗3次，每次5 min；將二抗用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育30 min后，用TBST在室溫脫色搖床上洗3次，每次5 min。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPad Prism 5.0 軟件行Two-way ANOVA、Bonferroni post-test和One-way ANOVA檢驗。

2　結(jié)　果

2.1體重變化各組大鼠在實驗過程中體重均平穩(wěn)增長，應(yīng)激前各組體重無明顯差異(P>0.05)，而從應(yīng)激開始后體重差異逐漸出現(xiàn)。接受慢性制動應(yīng)激的大鼠(應(yīng)激生理鹽水組、應(yīng)激丁酸鈉組)較未應(yīng)激大鼠(對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組)體重增長緩慢。與對照生理鹽水組相比，應(yīng)激丁酸鈉組在第8天、第21天體重有明顯降低(P<0.01)；而應(yīng)激生理鹽水組在第8、15、21天與對照生理鹽水組相比體重明顯降低(P<0.01)。對照生理鹽水組大鼠與對照丁酸鈉組相比體重略有減低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.2Y迷宮試驗結(jié)果在應(yīng)激結(jié)束后1 d，各組大鼠中分別隨機選出8只進行行為學(xué)測試，每組剩余6只取材用于生化指標檢測。各組大鼠進入新異臂的次數(shù)及停留時間百分比均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各組大鼠進入各個臂次數(shù)百分比組間無顯著差異，而組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)四組大鼠進入新異臂的次數(shù)均顯著高于其他兩臂(P<0.01)。而對于各組大鼠在三個臂的停留時間百分比的分析，組間分析無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，組內(nèi)分析發(fā)現(xiàn)，對照生理鹽水組、對照丁酸鈉組及應(yīng)激丁酸鈉組在新異臂的停留時間遠多于其他兩臂(P<0.01)，而應(yīng)激生理鹽水組在三個臂的停留時間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。單因素方差分析顯示應(yīng)激生理鹽水組〔(12.25±2.31)次〕在各個臂的總穿越次數(shù)較對照生理鹽水組〔(20.04±4.16)次〕多明顯減少(P<0.05)，應(yīng)激丁酸鈉組〔(14.36±1.87)次〕總穿越次數(shù)相對對照生理鹽水組和對照丁酸鈉組〔(18.41±2.79)次〕有所減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、表3。

表1　大鼠體重變化(g,n=14)

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.01

表2　Y迷宮試驗停留時間結(jié)果

表3　Y迷宮試驗停留時間、次數(shù)百分比結(jié)果

與其他兩臂比較：1)P<0.05

2.3Morris 水迷宮試驗結(jié)果Two-way ANOVA 顯示各組大鼠平均潛伏期組內(nèi)(F3，140=2.98)、組間(F4，140=88.45)均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Bonferroni posttest 顯示定位導(dǎo)航試驗第2天，對照丁酸鈉平均潛伏期較對照生理鹽水組有明顯增高(P<0.05)；而應(yīng)激生理鹽水組大鼠在訓(xùn)練第3天的平均潛伏期顯著高于對照生理鹽水組(P<0.01)。見表4。One-way ANOVA 顯示，大鼠在目標象限游泳時間百分比及穿越平臺區(qū)域的次數(shù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

采用Two-wayANOVA 對各組大鼠在目標象限及目標相反象限的游泳時間進行統(tǒng)計，組內(nèi)(F1，56=47.5，P<0.01)，而組間差異則不具有統(tǒng)計學(xué)意義(F3，56=0.39，P>0.05)。應(yīng)激生理鹽水組大鼠在兩個區(qū)域的游泳時間無明顯差異，而其余三組大鼠在目標象限的游泳時間均顯著高于其在目標相反象限的時間(P<0.01)。見表6。

2.4海馬acH3 和acH4 蛋白含量應(yīng)激生理鹽水組大鼠acH3 蛋白含量的低于對照生理鹽水組(t=2.73，P<0.05)，而acH4 蛋白含量雖有降低趨勢但卻無統(tǒng)計學(xué)意義；應(yīng)激丁酸鈉組與應(yīng)激生理鹽水組大鼠相比較，acH3、acH4 蛋白水平均明顯增加(P<0.01)；對照丁酸鈉組大鼠則與對照組蛋白表達水平無明顯差異。見表7。

表4　Morris 水迷宮試驗潛伏期結(jié)果

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

表5　Morris 水迷宮試驗平臺穿越結(jié)果

表6　Morris 水迷宮游泳時間結(jié)果

與同組目標相比較：1)P<0.01

表7　大鼠海馬acH3 和acH4 蛋白含量

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05；與對照丁酸鈉組比較：2)P<0.01

2.5海馬p-CREB、BDNF 含量應(yīng)激生理鹽水組大鼠海馬p-CREB 水平明顯低于對照生理鹽水組(P<0.01)，其BDNF 含量也低于對照生理鹽水組(P<0.05)；應(yīng)激丁酸鈉組與應(yīng)激生理鹽水組大鼠相比較p-CREB、BDNF 含量均有明顯增加(P<0.01、P<0.05)；對照丁酸鈉組大鼠相對于對照生理鹽水組BDNF 含量有所減少(P<0.05)，而p-CREB 含量則無明顯變化。見表8。

表8　大鼠海馬p-CREB、BDNF 含量

與對照生理鹽水組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與對照丁酸鈉組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3　討　論

本研究采用兩種迷宮來檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)和記憶水平，結(jié)果顯示慢性應(yīng)激能夠在一定程度上損害大鼠的空間識別記憶及空間參考記憶。慢性應(yīng)激可對大鼠的空間識別記憶造成損傷，這與之前的研究結(jié)果一致〔7～10〕。此外，應(yīng)激強度的改變對空間識別能力亦有影響，在Y 迷宮試驗中，本文說明應(yīng)激后大鼠的活動性降低，跟造模過程中對應(yīng)激大鼠的觀察一致。而對體重的分析同樣發(fā)現(xiàn)應(yīng)激造成了大鼠的抑郁樣行為，與眾多的實驗結(jié)果相一致〔11〕。在水迷宮定位導(dǎo)航試驗中發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激在一定程度上損傷了大鼠的空間參考記憶。丁酸鈉屬于非選擇性HDAC抑制劑，可以抑制I 和IIa 型HDAC。本文的研究發(fā)現(xiàn)，丁酸鈉可對大鼠空間記憶的損害起保護作用。同樣丁酸鈉對于大鼠的應(yīng)激后的抑郁樣行為也有輕微改善。正常大鼠腹腔給予丁酸鈉則不會對認知造成影響或造成認知功能的損害。免疫沉淀法研究發(fā)現(xiàn)，影響多種基因轉(zhuǎn)錄的啟動子附近組蛋白乙?；牟课辉贖3、H4，所以本文常檢測acH3、acH4 的表達來表示組織乙?；乃健?〕。本研究應(yīng)激對照說明慢性應(yīng)激可降低大鼠海馬乙酰化水平，尤其是acH3的乙?；剑∷徕c可以逆轉(zhuǎn)應(yīng)激大鼠這種乙?；慕档停绕涫菍τ贖4 的作用更為明顯；但丁酸鈉對正常大鼠海馬中兩種組蛋白的乙?；綗o顯著作用。最近一項關(guān)于HDAC 抑制的研究顯示〔11〕，丁酸鈉作用于離體的大鼠腦片，可顯著增加慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型大鼠海馬區(qū)域的組蛋白乙?；?，尤其是H4 的乙酰化較給予丁酸鈉的正常大鼠的腦片有顯著增加，這與本文的研究結(jié)果向一致。對另一種III 型HDAC 抑制劑sirtinol 的研究發(fā)現(xiàn)〔12〕，sirtinol 對應(yīng)激后的大鼠腦片作用明顯，可顯著增加應(yīng)激大鼠海馬CA3 及DG 組蛋白乙?；?，而對于正常大鼠，其對海馬區(qū)域乙酰化水平的增加幾乎沒有作用，甚至輕度降低了H3 的磷酸化水平，再次證明丁酸鈉對病理狀態(tài)的大鼠與對正常大鼠的作用效果不同。

本研究說明慢性束縛應(yīng)激顯著降低了海馬p-CREB 的含量，可能通過其對BDNF基因表達的調(diào)控，降低應(yīng)激大鼠海馬中該因子的含量，而丁酸鈉能夠逆轉(zhuǎn)這種蛋白的降低。結(jié)合組蛋白乙酰化的結(jié)果推測，丁酸鈉可能是通過調(diào)整海馬的乙?；捤?，增加相應(yīng)區(qū)域p-CREB 的含量，進而影響B(tài)DNF 的表達；而丁酸鈉對正常大鼠BDNF的表達有不利影響，這與本文行為學(xué)中丁酸鈉降低正常大鼠的認知功能的結(jié)果相一致，說明丁酸鈉對認知功能的作用與海馬中BDNF 的含量密切相關(guān)，再次證實BDNF 在動物認知功能中的重要作用，與既往的研究結(jié)果相吻合〔13〕。綜上研究結(jié)果可推測，組蛋白去乙?；付∷徕c對慢性制動應(yīng)激大鼠的認知功能具有保護作用，其機制可能是通過恢復(fù)慢性激大鼠海馬區(qū)域的組蛋白乙?；?，進而上調(diào)認知相關(guān)蛋白如p-CREB、BDNF 的表達來實現(xiàn)，其詳細機制需進一步實驗研究。本文闡明丁酸鈉對慢性應(yīng)激大鼠認知功能的作用機制，有望對預(yù)防及治療慢性應(yīng)激所致認知損害提供新的理論依據(jù)及治療方法。

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〔2016-01-18修回〕

(編輯滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.018

魏艷霞(1975-)，女，碩士，主要從事骨科與神經(jīng)科康復(fù)研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3391-04；