孫　彬　李福紅

(濟(jì)南市民族醫(yī)院，山東　濟(jì)南　250012)

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不同頻率電針足三里對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌核因子-κB、血清腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-1β的影響

孫彬李福紅1

(濟(jì)南市民族醫(yī)院，山東濟(jì)南250012)

目的研究不同頻率電針對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠腓腸肌核因子(NF)-κB、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的影響。方法采用Bedford漸增負(fù)荷跑臺(tái)跑運(yùn)動(dòng)模型，用韓式電針儀對(duì)運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠雙側(cè)足三里穴進(jìn)行2/15 Hz、2/100 Hz兩種不同頻率的刺激，觀察血清睪酮/皮質(zhì)酮比值、腓腸肌NF-κB含量、血清TNF-α和IL-1β含量的變化。結(jié)果①與安靜對(duì)照組比較，運(yùn)動(dòng)組大鼠血清睪酮/皮質(zhì)酮比值顯著降低(P<0.05，P<0.01)；②運(yùn)動(dòng)組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β顯著升高(P<0.05，P<0.01)；③運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組兩組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β與運(yùn)動(dòng)后60 min組比較差異顯著(P<0.05，P<0.01)；④運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β與運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組比較，差異顯著(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論①急性運(yùn)動(dòng)后可顯著增加大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β含量；②不同頻率電針均可降低急性運(yùn)動(dòng)后大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β的含量；③2/15 Hz可能是要篩選的電針消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的最佳頻率。

電針頻率；運(yùn)動(dòng)性疲勞；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；白細(xì)胞介素-1β

電針抗運(yùn)動(dòng)性疲勞實(shí)驗(yàn)已有報(bào)道〔1～3〕,提示電針可促進(jìn)運(yùn)動(dòng)性疲勞恢復(fù)，但電針抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的適宜頻率目前仍不清楚。本研究采用Bedford漸增負(fù)荷跑臺(tái)跑運(yùn)動(dòng)模型建立急性運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠模型，測(cè)定安靜組、運(yùn)動(dòng)組大鼠及在不同頻率電針刺激運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠后腓腸肌細(xì)胞核因子(NF)-κB、血清腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-1β的變化，探討不同頻率電針抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的效應(yīng)，以便篩選更有效的針刺頻率。

1　材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取50只健康、運(yùn)動(dòng)能力正常、體重(260±5)g的雄性SD大鼠，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。動(dòng)物房?jī)?nèi)保持室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度45%～65%，自然晝夜節(jié)律變化光照，自由進(jìn)水和食物(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)固體混合飼料，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及選模大鼠常規(guī)飼養(yǎng)并適應(yīng)環(huán)境2 d后，隨機(jī)分為：安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)后即刻組、運(yùn)動(dòng)后60 min組、運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組。造模方案參照Bedford漸增負(fù)荷跑臺(tái)跑運(yùn)動(dòng)模型〔4〕，總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為120 min左右，運(yùn)動(dòng)中采用木棒刺激維持運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。

1.3治療手段取材當(dāng)天，于運(yùn)動(dòng)后30 min對(duì)大鼠進(jìn)行電針治療30 min，采用28號(hào)1寸毫針，75%酒精穴位消毒后針刺大鼠足三里穴(腓骨小頭下0.5 cm)〔5〕，連接韓氏電針儀，頻率不同，波型為疏密波，電流強(qiáng)度為2 mA。安靜對(duì)照組：不運(yùn)動(dòng)，也不進(jìn)行電針治療。運(yùn)動(dòng)后即刻組：按計(jì)劃進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)后即刻取材。運(yùn)動(dòng)后60 min組：按計(jì)劃進(jìn)行運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)后60 min后取材。運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組：運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練30 min后，進(jìn)行電針治療，頻率為 2 Hz、15 Hz交替。電針后即刻取材。運(yùn)動(dòng)+電針2/100 Hz組：運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練30 min后，進(jìn)行電針治療，頻率為2 Hz、100 Hz交替。電針后即刻取材。

1.4取材用大鼠專(zhuān)用斷頭大剪刀將大鼠斷頭處死。取全血約5 ml，靜置于4℃冰箱中30 min，待凝固后以3 000 r/min的速度離心20 min，分離血清，分裝于EP管中，置于-80℃冰箱低溫保存，待測(cè)。迅速取大鼠腓腸肌適量，浸泡于4%多聚甲醛液中固定，待測(cè)。

1.5指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1一般情況在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中詳細(xì)記錄大鼠的進(jìn)食、進(jìn)水情況，觀察動(dòng)物皮毛色澤、神態(tài)活動(dòng)、運(yùn)動(dòng)能力等。造模開(kāi)始前及實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天記錄大鼠體重變化。

1.5.2血清皮質(zhì)酮(C)的測(cè)定采用放射免疫法測(cè)定。將待測(cè)血清樣本、125I標(biāo)記的C和C抗體充分搖勻后，經(jīng)37℃溫育45 min，加入分離劑混勻，在室溫中靜置15 min，離心15 min，吸棄上清液后，測(cè)沉淀物的放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算出B/Bo%，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出血清C濃度。

1.5.3血清睪酮(T)的測(cè)定采用放射免疫法測(cè)定。將待測(cè)血清樣本、125I標(biāo)記的T和T抗體充分搖勻后，經(jīng)37℃溫育1 h后，加入分離劑混勻，在室溫中靜置30 min，4℃ 3 500 r/min離心15 min，吸棄上清液后，測(cè)沉淀物的放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算出樣本的B/Bo%，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出血清T濃度。

1.5.4血清IL-1β和TNF-α的測(cè)定采用放射免疫法測(cè)定。將待測(cè)血清樣本、125I標(biāo)記的IL-1β、IL-1β抗體和TNF-α、TNF-α抗體充分搖勻后，4℃放置24 h以上，加入分離劑混勻，在室溫中靜置15 min，4℃3 500 r/min離心15 min，棄上清液后，測(cè)沉淀物的放射性計(jì)數(shù)。計(jì)算出樣本的B/Bo%，查標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出血清IL-1β和TNF-α濃度。

1.5.5腓腸肌NF-κB的測(cè)定取大鼠腓腸肌適量浸泡于4%多聚甲醛液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片。NF-κB p65的檢測(cè)用免疫組織化學(xué)染色法，按試劑盒說(shuō)明書(shū)將切片常規(guī)脫蠟至水后，用新鮮3%H2O2滅活內(nèi)源性酶10 min，PBS洗5 min×2次；置于檸檬酸緩沖液中(pH 6.0)微波修復(fù)抗原5 min×2次，PBS洗5 min×2次；滴加一抗(兔抗鼠NF-κB p65亞單位的多克隆抗體，經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)定為稀釋度1∶100)，冰箱4 ℃過(guò)夜，PBS洗5 min×3次；滴加二抗(羊抗兔IgG)，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min×2次；滴加SABC試劑30 min，PBS洗5 min×2次；DAB顯色，顯微鏡觀察，自來(lái)水充分沖洗；蘇木素輕度復(fù)染；梯度乙醇脫水，中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)腓腸肌細(xì)胞中染色陽(yáng)性的細(xì)胞核(呈棕黃色)，以其細(xì)胞核陽(yáng)性數(shù)占細(xì)胞核總數(shù)的百分比，即細(xì)胞核的陽(yáng)性率，作為腓腸肌細(xì)胞NF-κB活性的反映。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1血清T/C比值的變化運(yùn)動(dòng)后60 min組大鼠血清T/C比值較安靜對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，運(yùn)動(dòng)后即刻組較安靜對(duì)照組亦明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1　運(yùn)動(dòng)大鼠血清T、C及T/C比值變化

與安靜對(duì)照組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.2腓腸肌NF-κB含量的變化運(yùn)動(dòng)后即刻組大鼠腓腸肌NF-κB的含量〔(16.5±2.8)%〕明顯高于安靜對(duì)照組〔(11.2±2.9)%(P<0.05)〕。運(yùn)動(dòng)后60 min組大鼠腓腸肌NF-κB的含量〔(41.6±6.0)%〕顯著高于安靜對(duì)照組(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組〔(30.5±3.8)%〕和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針〔(34.9±3.9)%〕組與運(yùn)動(dòng)后60 min組相比，前兩組大鼠腓腸肌NF-κB的含量明顯低于后者(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組相比，前者腓腸肌NF-κB的含量明顯低于后者(P<0.05)。

2.3血清TNF-α含量的比較運(yùn)動(dòng)后即刻組大鼠血清TNF-α含量〔(0.849±0.228)ng/ml〕均明顯高于安靜對(duì)照組〔(0.569±0.136)ng/ml，(P<0.05)〕。運(yùn)動(dòng)后60 min組大鼠血清TNF-α含量〔(1.009±0.332)ng/ml〕顯著高于安靜對(duì)照組(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)+2/15Hz電針組〔(0.47±0.135)ng/ml〕與運(yùn)動(dòng)后60 min組相比，前者大鼠血清TNF-α含量明顯低于后者(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組〔(0.735±0.192)ng/ml〕與運(yùn)動(dòng)后60 min組相比，前者大鼠血清TNF-α含量明顯低于后者(P<0.05)。運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組相比，前者血清TNF-α亦明顯低于后者(P<0.05)。

2.4血清IL-1β含量的比較運(yùn)動(dòng)后即刻組〔(0.268±0.033)ng/ml〕和運(yùn)動(dòng)后60 min組〔(0.277±0.038)ng/ml〕大鼠血清IL-1β含量均高于安靜對(duì)照組〔(0.222±0.064)ng/ml(P<0.05)〕。運(yùn)動(dòng)+2/15 Hz電針組〔(0.161±0.031)ng/ml〕和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組〔(0.203±0.038)ng/ml〕與運(yùn)動(dòng)后60 min組相比，前兩組大鼠血清IL-1β含量明顯低于后者(P<0.01)。運(yùn)動(dòng)+ 2/15 Hz電針組和運(yùn)動(dòng)+2/100 Hz電針組相比，前者血清IL-1β含量明顯低于后者(P<0.05)。

3　討　論

血清T/C比值是評(píng)定運(yùn)動(dòng)性疲勞的常用指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)性疲勞動(dòng)物模型造模成功。

NF-κB活化是機(jī)體效應(yīng)細(xì)胞大量釋放促炎細(xì)胞因子的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔6〕。在TNF-α啟動(dòng)子上存在著NF-κB 結(jié)合位點(diǎn),有實(shí)驗(yàn)也證明NF-κB 對(duì)TNF-α的表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用〔7〕。TNF-α是運(yùn)動(dòng)中最早產(chǎn)生的關(guān)鍵的細(xì)胞因子,可誘導(dǎo)產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì),如IL-1β、IL-6等的產(chǎn)生。有研究顯示〔8，9〕，運(yùn)動(dòng)激活肌肉中NF-κB繼而引起炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，加重肌肉損傷。而運(yùn)動(dòng)尤其是大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可導(dǎo)致腓腸肌NF-κB和血漿IL-1β、TNF-α升高。Veneroso等〔10〕報(bào)道小鼠急性運(yùn)動(dòng)(速度為25 m/min，10%坡度，持續(xù)時(shí)間為60 min)后，骨骼肌中NF-κB活性升高，血清TNF-α、IL-1濃度亦升高。Richard〔11〕報(bào)道小鼠在跑臺(tái)上以20 m/min運(yùn)動(dòng)5～60 min后，在訓(xùn)練后的1～3 h，在腓腸肌的紅肌中，NF-κB活性增加了50%。朱榮〔12〕報(bào)道大鼠進(jìn)行1次大強(qiáng)度上坡跑運(yùn)動(dòng)(25 m/min，5%坡度,1 h)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組運(yùn)動(dòng)后1h細(xì)胞核NF-κB結(jié)合DNA能力非常顯著高于安靜時(shí)(P<0.01)。Liao等〔13〕觀察到SD大鼠以25 m/min在-10%跑臺(tái)上運(yùn)動(dòng)1、2 h后，血清中TNF-α明顯升高。Moldoveanu等〔14〕讓受試者在60%～65%VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)3 h，血漿IL-1β濃度在運(yùn)動(dòng)至1 h顯著增加，運(yùn)動(dòng)至3 h達(dá)到最高值。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示電針可降低運(yùn)動(dòng)性疲勞大鼠腓腸肌NF-κB、血清TNF-α和IL-1β的含量，有緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的作用。在刺激強(qiáng)度、刺激時(shí)間等因素固定的情況下，2/15 Hz電針緩解運(yùn)動(dòng)性疲勞的效果優(yōu)于2/100 Hz電針。這與以往的研究報(bào)道一致〔15,16〕。因此，低頻電針可能是電針消除運(yùn)動(dòng)性疲勞的最佳頻率。

1劉建宇，劉黎明.電針干預(yù)對(duì)大強(qiáng)度耐力運(yùn)動(dòng)機(jī)體自由基代謝的影響〔J〕.針刺研究，2013；38(1)：48-51.

2方劍喬，馬桂芝，梁宜.不同時(shí)間經(jīng)皮穴位點(diǎn)刺激抗大鼠慢性運(yùn)動(dòng)性疲勞以及對(duì)海馬和下丘腦形態(tài)與5-羥色胺表達(dá)的影響〔J〕.上海針灸雜志，2010；29(11)：735-8.

3王莉，賈成文，楊斌.不同時(shí)段針刺對(duì)消除運(yùn)動(dòng)性疲勞作用的初步觀察〔J〕.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011；17(3)：312-3.

4張勇，文立，聶金雷，等.運(yùn)動(dòng)性疲勞的線(xiàn)粒體膜分子機(jī)制研究 Ⅲ.線(xiàn)粒體質(zhì)子跨膜勢(shì)能與運(yùn)動(dòng)性?xún)?nèi)源自由基生成的關(guān)系〔J〕.中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志，2000；19(4)：346-9.

5華興邦.大白鼠穴位圖譜的研究〔J〕.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，1991；1(1)：1-3.

6Lee JI,Burekart GJ.Nuclear factor-kappa B:important transcription factor and therapeutic target〔J〕.J Clin Pharmacol,1988；38:981-93.

7Wright G,Singh IS,Hasday JD,etal.Endotoxin stress response in cardiomyocytes:NF-kappa B activation and tumor necrosis factor-alpha expression〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2002；282(3)：872.

8Jimenezjimenez R,Cuevas MJ,Alamar M,etal.Eccentric training impairs NF-kappaB activation and over-expression of inflammation-related genes induced by acute eccentric exercise in the elderly 〔J〕.Mech Ageing Dev,2008；129(6):313-21.

9Kramer HF,Good LJ.Exercise,MAPK,and NF-kappaB signaling in skeletal muscle 〔J〕.J Appl Physiol,2007；103(1):388-95.

10Veneroso C,Tunon MJ,Gonzalez-Gallego J,etal.Melatonin reduces cardiac inflammatory injury induced by acute exercises 〔J〕.J Pineal Res,2009；47(2):184-91.

11Richard CH.Regulation of I kappa B kinase and NF-kappa B in contracting adult rat skeletal muscle〔J〕.Am J Physiol Cell Physiol ,2005;289(4):794-801.

12朱榮.阻斷NF-κB信號(hào)對(duì)急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后泛素蛋白酶體途徑降解骨骼肌蛋白質(zhì)的影響〔J〕.北京體育大學(xué)學(xué)報(bào)，2014；37(1)：76-81.

13Liao P,Zhou J,Zhang Y，etal.Eccentric contraction induces inflammatory responses in rat skeletal muscle:role of tumor necrosis factor-α〔J〕.Am J Physiol Integr Comp Physiol,2010；298:R599-607.

14Moldoveanu AI,Shephard RJ,Shek PN.Exercise elevates plasma levels but not gene expression of IL-1 beta，IL-6,and TNF-alpha in blood mononuclear cells 〔J〕.J Appl Physiol,2000；89(4):1499-504.

15冷曉春，鄧振.不同頻率電針足三里對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠下丘腦單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2010；30(7)：951-2.

16李軍漢，黃雷.不同頻率電針足三里防治大鼠運(yùn)動(dòng)性疲勞的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.四川體育科學(xué)，2011；12(4)：41-4.

〔2014-12-09修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.016

孫彬(1972-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事全科醫(yī)學(xué)研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3387-03；

1中國(guó)重型汽車(chē)集團(tuán)有限公司醫(yī)院