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腦鈉肽及Smad蛋白調(diào)節(jié)的自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化及依那普利的干預作用

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(廣東醫(yī)學院附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東湛江524001)

目的探討腦鈉肽(BNP)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2/Smad蛋白調(diào)節(jié)的自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化及依那普利的干預作用。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組、假手術(shù)組、高血壓模型組、BMP-2拮抗劑noggin低、中、高劑量組和依那普利組(n=6)。采用在左心室游離壁5個點直接注入Ad5-HGF復制自發(fā)性高血壓大鼠模型，noggin低(1 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高劑量組(25 mg/kg)和依那普利組(20 mg/kg)分別給予對應藥物灌胃治療30 d。分析各組大鼠血壓變化，并檢測心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑蛋白(TIMP)、Ⅰ型膠原、α-平滑肌激動蛋白、羥脯氨酸、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和BNP及BMP-2/Smad蛋白水平變化。結(jié)果與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠血壓、收縮壓和舒張壓明顯升高(P<0.01)，且心肌組織中MMP-2、TIMP-1、MMP-9及羥脯氨酸、Ⅰ型膠原、α-平滑肌蛋白水平明顯升高，Smad和BNP及BMP-2水平明顯升高而TGF-β水平明顯降低(P<0.01)，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。結(jié)論自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織發(fā)生明顯的纖維化過程，且依那普利能通過調(diào)控BNP-Smad及MMP家族發(fā)揮改善作用。

自發(fā)性高血壓；纖維化；依那普利；基質(zhì)金屬蛋白酶；羥脯氨酸

目前關(guān)于高血壓所致的心肌組織重構(gòu)和心肌纖維化過程的確切發(fā)病機制尚不明確。Smad蛋白是細胞內(nèi)介導多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的重要蛋白，也是藥物治療的可能的潛在靶點；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)及其抑制劑是細胞外基質(zhì)降解與組織重構(gòu)的關(guān)鍵蛋白，也是組織纖維化進程的重要指標〔1〕。本研究擬分析腦鈉肽(BNP)及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2/Smad蛋白調(diào)節(jié)的自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化及依那普利的干預作用。

1　材料與方法

1.1動物及分組清潔級雄性SD大鼠購自廣東醫(yī)學院實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2003-0007，大鼠體重210～230 g。所有實驗動物均在恒溫(22℃±2℃)恒濕(55%±5%)條件下適應性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲食。雄性SD大鼠隨機分為對照組、假手術(shù)組、高血壓模型組、BMP-2拮抗劑noggin低、中、高劑量組和依那普利組(n=6)。所有操作均符合本省實驗動物管理條例的規(guī)定。

1.2模型復制大鼠適應性飼養(yǎng)1 w。除對照組和假手術(shù)組外，其余各組大鼠采用在左心室游離壁5個點直接注入轉(zhuǎn)染人肝細胞生長因子腺病毒(Ad5-HGF)復制自發(fā)高血壓大鼠模型，假手術(shù)組大鼠采取相同的操作，僅注入溶劑生理鹽水而不注入Ad5-HGF。1 w后藥物治療組分別給予對應藥物治療：noggin低(1 mg/kg)、中(5 mg/kg)、高劑量組(25 mg/kg)和依那普利組(20 mg/kg)分別給予對應藥物灌胃治療30 d，對照組、假手術(shù)組和模型組大鼠給予等劑量的溶劑羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)灌胃治療30 d。

1.3檢測指標造模結(jié)束后頸總動脈放血處死動物并分離血清，分離左心室后于液氮總保存，待用。本文分析各組大鼠造模前后及藥物治療前后血壓變化，并檢測心肌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑蛋白、I型膠原、α-平滑肌激動蛋白、羥脯氨酸、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β和BNP及BMP-2/Smad蛋白水平變化。

1.4試劑總蛋白提取試劑盒及蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究中心；MMP-2及MMP-9蛋白檢測試劑盒購自O(shè)mega公司；TIMP-1蛋白檢測試劑盒購自R&D公司；TGF-β及BNP蛋白檢測試劑盒購自BIOO公司；羥脯氨酸及Ⅰ型膠原蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；血管平滑肌肌動蛋白(α-SMA)蛋白檢測試劑盒購自南京檢測生物工程研究所；Samd蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司；BMP蛋白檢測試劑盒購自Santa Cruz公司。所有操作過程均按照說明書進行。

1.5免疫印跡法各組大鼠心肌組織于0℃冰水浴中勻漿，并以等量總蛋白與5×上樣緩沖液(1∶5)混合煮沸5 min后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳。電泳完畢后剝離PAGE膠并進行半干法轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜膜2 h，然后將纖維素膜用5.0%胎牛血清白蛋白封閉1 h。磷酸緩沖液沖洗3次(每次10 min)后與第一抗體于4℃條件下孵育3 h；無菌磷酸緩沖液沖洗3次(每次10 min)，然后與第二抗體孵育3 h，無菌磷酸緩沖液沖洗3次(每次10 min)。然后進行顯色、定影，并計算光密度。以β-actin作為內(nèi)參。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析、χ2檢驗。

2　結(jié)　果

2.1自發(fā)性高血壓大鼠血壓變化及依那普利的干預作用與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠血壓、收縮壓和舒張壓明顯升高，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。見表1。

表1　自發(fā)性高血壓大鼠血壓變化及依那普利的干預作用

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與假手術(shù)組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與低劑量組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；與中劑量組比較：7)P<0.05；下表同，下圖同

2.2自發(fā)性高血壓大鼠MMP表達變化及依那普利的干預作用與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠心肌組織MMP-2、TIMP-1和MMP-9表達明顯升高，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常表達的蛋白得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。見表2。

2.3自發(fā)性高血壓大鼠TGF-β和BNP蛋白水平變化及依那普利的干預作用與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠心肌組織中BNP表達明顯升高而TGF-β蛋白表達明顯降低，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常表達的蛋白得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。見圖1。

2.4自發(fā)性高血壓大鼠羥脯氨酸及Ⅰ型膠原和α-平滑肌蛋白水平變化及依那普利的干預作用與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠心肌組織中羥脯氨酸及Ⅰ型膠原和α-平滑肌蛋白表達明顯升高，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常表達的蛋白得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。見表3。

圖1　自發(fā)性高血壓大鼠TGF-β和BNP蛋白水平變化及依那普利的干預作用

組別MMP-2TIMP-1MMP-9對照組0.30±0.040.26±0.050.18±0.02假手術(shù)組0.29±0.020.26±0.060.19±0.04模型組0.68±0.102)4)0.70±0.122)4)0.55±0.112)4)低劑量組0.67±0.072)4)0.68±0.092)4)0.54±0.102)4)中劑量組0.62±0.111)3)5)0.57±0.131)3)5)0.48±0.052)4)5)高劑量組0.46±0.131)3)6)7)0.40±0.101)3)6)7)0.31±0.081)3)5)7)依那普利組0.45±0.091)3)6)7)0.42±0.071)3)6)7)0.33±0.071)3)6)7)

2.5自發(fā)性高血壓大鼠BMP-2/Smad蛋白水平變化及依那普利的干預作用與對照組和假手術(shù)組相比，自發(fā)性高血壓模型組大鼠心肌組織中BMP-2和Smad蛋白表達明顯升高，而依那普利和BMP-2拮抗劑組上述異常表達的蛋白得到明顯的改善(P<0.01)，且拮抗劑noggin作用具有劑量依從性效果(P<0.01)。見圖2。

表3　自發(fā)性高血壓大鼠羥脯氨酸及Ⅰ型膠原和α-平滑肌蛋白水平變化及依那普利的干預作用±s,n=6)

圖2　自發(fā)性高血壓大鼠BMP-2/Smad蛋白水平變化及依那普利的干預作用

3　討　論

高血壓導致的心血管重構(gòu)是其威脅健康的重要方面，但是目前其發(fā)病機制尚不明確。本文提示自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織發(fā)生明顯的纖維化過程，且依那普利能通過調(diào)控BNP-Smad及MMP家族發(fā)揮改善作用。

Smad蛋白是信號內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的重要組分，其表達異常與多種心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)〔2〕。在研究佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心肺功能損傷與TGF-β1/Smad2、4、7通路關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)Smad蛋白表達異常參與了佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心肺功能異?！?〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)TGF-β1/Smad2信號通路參與了壓力超負荷所致的大鼠心肌纖維化病理過程，而淫羊藿苷通過抑制該通路的過度活化減輕心肌纖維化過程〔4〕。以往的研究還證實肺心清膠囊能夠改善大鼠肺纖維化癥狀，且此過程與其抑制細胞因子TGF-β1、Smad2/3的表達相關(guān)〔5〕，且四逆湯對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化的改善作用也是通過調(diào)控Smad2和Smad7實現(xiàn)的〔6〕。本研究也表明該通路也參與了此模型中心肌纖維化過程，且依那普利能通過抑制該通路發(fā)揮治療作用。MMP是細胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)的關(guān)鍵酶，其也參與了多種組織的纖維化過程〔7〕。本研究也表明MMP及其抑制劑也參與了此模型中心肌纖維化過程，且依那普利能通過抑制其異常表達發(fā)揮治療作用。

綜上所述，自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織發(fā)生明顯的纖維化過程，且依那普利能通過調(diào)控BNP-Smad及MMP家族發(fā)揮改善作用。

1馮寒，張城林，吳丹，等.CTRP3通過抑制Smad3通路和肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化減輕心肌梗死后心肌纖維化〔J〕.中國病理生理雜志，2015；31(10)：1793-5.

2丁雪峰，周京敏，朱凌倜，等.芪藶強心提取物阻斷Smad3信號通路抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心臟成纖維細胞轉(zhuǎn)分化〔J〕.中國分子心臟病學雜志，2014；14(6)：1144-8.

3黃傳兵，萬磊，劉健，等.佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠心肺功能損傷與TGF-β1/Smad2、4、7通路的關(guān)系〔J〕.安徽醫(yī)科大學學報，2014；49(7)：901-5.

4張麗梅，楊競，李意奇，等.淫羊藿苷抑制TGF-β1/Smad2信號通路改善壓力超負荷所致的大鼠心肌纖維化〔J〕.中國藥理學通報，2013；29(10)：1422-5.

5呂路艷，李青，宋精玲，等.肺心清膠囊對大鼠肺纖維化及其細胞因子TGF-β1、Smad2/3作用的實驗研究〔J〕.臨床肺科雜志，2012；17(4)：585-7.

6廖火城，劉勇，周彬，等.四逆湯對異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌纖維化Smad2和Smad7的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012；32(7)：934-8.

7巴圖德力根，徐艷華，韓志強，等.德都紅花-7味散對基質(zhì)金屬蛋白酶及轉(zhuǎn)化生長因子β1在肝纖維化中表達的影響〔J〕.中國臨床藥理學雜志，2015；31(15)：1526-9.

〔2015-10-25修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.014

湛江市非資助科技攻關(guān)計劃項目(No.2013B01298)

李日健(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事心臟起搏、冠脈介入治療、頑固性心力衰竭診治研究。

R541.3

A

1005-9202(2016)14-3381-03；