陳素賢　萬義增　楊　悅　李敬巖　李　倫

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧　錦州　121000)

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馬兜鈴酸作用下腎小管上皮細胞尾加壓素Ⅱ、轉(zhuǎn)化生長因子-β1的表達及相互關系

陳素賢萬義增楊悅李敬巖李倫

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院病理科，遼寧錦州121000)

目的觀察馬兜鈴酸(AA)作用下尾加壓素(U)Ⅱ和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1在腎小管上皮細胞(NRK-52E)中的表達及相互關系。方法常規(guī)培養(yǎng)的NRK-52E細胞分別加入DMEM培養(yǎng)基、AA、AA+ UⅡ、AA+ UⅡ+抗UⅡ抗體，培養(yǎng)24、36、48 h，用RT-PCR技術檢測UⅡ、TGF-β1mRNA表達水平。結果與DMEM組比較，AA組NPK-52E細胞UⅡ和TGF-β1基因表達均明顯增強(P<0.05)；與AA組比較，AA+ UⅡ組TGF-β1表達明顯增強(P<0.01)；與AA+ UⅡ組比較，AA+ UⅡ+抗UⅡ抗體組TGF-β1基因表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結論AA作用下，NRK-52E細胞UⅡ和TGF-β1表達水平均升高，且UⅡ可誘導TGF-β1的表達，提示二者在AA腎病發(fā)生發(fā)展中可能有一定作用，且二者相互關聯(lián)。

馬兜鈴酸；尾加壓素Ⅱ；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

含馬兜鈴酸(AA)的藥物主要在腎臟代謝，并且可以不斷蓄積，且病變多為不可逆，成為許多老年患者腎衰竭的主要原因。尾加壓素(U)Ⅱ是迄今發(fā)現(xiàn)的最強的體內(nèi)縮血管活性物質(zhì)，在腎臟尤其是近曲小管有豐富的表達。UⅡ及其受體mRNA在AA腎病的腎臟表達增強〔1〕。諸多研究表明，UⅡ在腎臟疾病中有一定作用。轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1具有多種功能，在細胞的免疫調(diào)節(jié)、生長分化、損傷修復等方面發(fā)揮著重要作用。TGF-β1可誘導腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化〔2〕。UⅡ與TGF-β1在腎臟疾病中均有重要作用，但二者在AA發(fā)病中有無作用、有無關系及關系如何尚未見報道。本研究從細胞水平探討AA作用下二者的表達規(guī)律及其相互關系。

1　材料與方法

1.1材料馬兜鈴酸鈉購自中國藥品生物制品檢定所。DMEM為Gibco公司產(chǎn)品。UⅡ及抗UⅡ抗體購自Sigma公司。 Trizol、逆轉(zhuǎn)錄酶AMV 、TaqDNA聚合酶等購自新西蘭Invitrogen公司。腎小管上皮細胞NRK-52E由吉林大學藥學院藥理與毒理學教研室饋贈。

1.2細胞培養(yǎng)與處理常規(guī)培養(yǎng)的NRK-52E細胞，用胰酶消化(0.25%)，制成懸液，接種于12孔培養(yǎng)板，每組設6個復孔，細胞數(shù)1×104個/孔。貼壁培養(yǎng)24 h后，用含0.5%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞同步后分別加入：單純DMEM、AA(40 mg/L)、AA+ UⅡ(10-8mol/L)、AA+ UⅡ+抗UⅡ抗體(10-5mol/L)。繼續(xù)培養(yǎng)24、36、48 h，收集細胞用于RT-PCR檢測。

1.3指標檢測RT-PCR檢測細胞UⅡ和TGF-β1 mRNA的表達。UⅡ正義引物：5′-TGC CTG CTC TTC GTA GGA CT-3′，反義：5′-AGA GCC TTC CTC AAG CTT CC-3′，擴增產(chǎn)物242 bp。 TGF-β1正義引物：5′-GAC CTC AAT TGC GAG CTT TC-3′，反義：5′-AGT CCT CCT TCC GCC TTT AG-3′，擴增產(chǎn)物382 bp。內(nèi)參GAPDH引物，正義：5′-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3′，反義：5′-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3′，擴增產(chǎn)物450 bp。提取細胞總RNA，總體積為25 μl。94℃變性5 min后，94℃變性45 s，退火45 s，72℃延伸45 s。退火溫度分別為：UⅡ為53℃，TGF-β1為59℃，GAPDH為55℃。經(jīng)過30個循環(huán)，72℃再次延伸10 min。運用凝膠成像處理系統(tǒng)，對瓊脂糖凝膠電泳結果進行灰度掃描，以GAPDH密度作為參考定量標準，UⅡ、TGF-β1的表達量以UⅡ、TGF-β1與GAPDH密度之比來表示。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行t檢驗。

2　結　果

2.1AA組UⅡ和TGF-β1基因表達與單純DMEM培養(yǎng)基組比較，AA組NRK-52E細胞UⅡ基因表達在實驗的3個時間段均明顯增強(P<0.05)；TGF-β1 mRNA的表達在48 h明顯增強(P<0.05)。見圖1，表1。

2.2各組TGF-β1 mRNA表達見表2，圖2。與AA組比較，AA+ UⅡ組TGF-β1 mRNA表達36 h、48 h明顯升高(P<0.01)。與馬兜鈴酸鈉+ UⅡ組比較，工+ UⅡ+抗UⅡ抗體組TGF-β1 mRNA表達36 h明顯降低(P<0.05)，48 h顯著降低(P<0.01)。

1：24 h DMEM組；2：24 h AA組；3：36 h DMEM組；4：36 h AA組；5：48 h DMEM組；6：48 h AA組圖1　AA作用下大鼠NRK-52E細胞UⅡ和TGF-β1基因的表達

組別UⅡ24h36h48hTGF-β124h36h48hDMEM組0.49±0.120.55±0.090.62±0.070.32±0.060.37±0.080.39±0.08AA組0.64±0.091)0.75±0.101)0.78±0.101)0.44±0.040.47±0.030.58±0.031)

與DMEM組比較：1)P<0.05

表2　TGF-β1 mRNA在各組NRK-52E細胞中的表達

與AA組比較：1)P<0.01；與AA+UⅡ組比較：2)P<0.01，3)P<0.05

3　討　論

UⅡ最初作為一種血管活性肽被發(fā)現(xiàn)，隨著對它研究的不斷深入，UⅡ的非血流動力學作用被揭示：它不僅能促進細胞外基質(zhì)表達、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌，還能促進腎小管上皮細胞的增殖〔3，4〕，激活大鼠腎小管上皮細胞的表皮生長因子受體〔5〕，抑制鉀、鈉的重吸收〔6〕，促進細胞內(nèi)Ca2+的釋放〔7〕，抑制NRK-52E細胞的凋亡〔8〕?？傊?，UII與腎臟及其疾病的病理生理學改變密切相關。

TGF-β1是一種多功能的細胞因子，它既可以促進ECM的積聚，使腎臟疾病向纖維化的方向發(fā)展，同時又是組織損傷、自身修復的重要成分，在多種疾病中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，TGF-β1在近曲小管和集合管有表達。急性缺血性腎損傷時，新生NRK-52E細胞TGF-β1的表達及活性均明顯增加，提示TGF-β1在腎小管再生中有重要作用。但在損傷修復后TGF-β1持續(xù)增加可使膠原沉積，導致腎的纖維化的發(fā)生。

糖尿病腎臟纖維化時UⅡ、TGF-β1表達均增強，二者很可能是通過自分泌和(或)旁分泌機制，在腎臟纖維化中發(fā)揮著重要作用〔8〕。Kemp等〔9〕發(fā)現(xiàn)，高劑量UⅡ可使肝細胞中TGF-β上升。Zhang等〔10〕發(fā)現(xiàn)TGF-β1參與UⅡ誘導的大鼠主動脈成纖維細胞的表型分化。本研究表明UⅡ與TGF-β1在AA腎病的發(fā)生發(fā)展中具有一定的作用，且UⅡ可誘導TGF-β1的表達，UⅡ的這種作用其中至少一部分是通過抗原-抗體途徑來實現(xiàn)的，至于是否存在其他途徑，還有待進一步研究。

1陳素賢，李才，于曉艷，等.尾加壓素Ⅱ及其受體在急性腎損傷大鼠腎組織中的表達〔J〕.中國病理生理雜志，2011;27(7)：1406-8.

2曾紅，周懿，姚國媛.轉(zhuǎn)化生長因子誘導人腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化：Notch1受體阻斷劑的影響〔J〕.中國組織工程研究，2014;18(51)：8261-8.

3陳素賢，李才，苗春生，等.尾加壓素Ⅱ?qū)Υ笫竽I小管上皮細胞的促絲裂作用〔J〕.吉林大學學報(醫(yī)學版)，2007；33(2)：204-6.

4Sue YM，Chen CH，Hsu YH，etal.Urotensin Ⅱ induces transactivation of the epidermal growth factor receptor via transient oxidation of SHP-2 in the renal tubular cell line NRK-52E〔J〕.Growth Factors，2009；27(3)：155-62.

5Abdel-Razik AE，F(xiàn)orty EJ，Balment RJ，etal.Renal haemodynamic and tubular actions of urotensin Ⅱ in the rat〔J〕.J Endocrinol，2008；198(3)：617-24.

6Adebivi A.RGS2 regulates urotensin Ⅱ-induced intracellular Ca2+elevation and contraction in glomerular mesangial cells〔J〕.J Cell Physiol，2014；229(4)：502-11.

7Hsu YH，Chen TH，Chen YC，etal.Urotensin Ⅱ exerts antiapoptotic effect on NRK-52E cells through prostacyclin-mediated peroxisome proliferator-activated receptor alpha and Akt activation〔J〕.Mol Cell Endocrinol,2013；381(1-2)：168-74.

8Tian L，Li C，Qi J，etal.Diabeles-induced upregulation of urotensin Ⅱ and its receptor plays an important role in TGF-beta 1-mediated renal fibrosis and dysfunction〔J〕.Am J Physiol Endocrinol Melab，2008；295(5)：1234-42.

9Kemp W，Kompa A，Phrommintikul A，etal.Urotensin Ⅱ modulates hepatic fibrosis，and portal hemodynamic alterations in rats〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physol，2009；297(4)：762-7.

10Zhang YG，Hu YC，Mao YY，etal.Transforming growth factor-beta1 involved in urotensin Ⅱ-induced phenotypic differetiation of adventitial fibro blasts from rat aorta〔J〕.Chin Med J，2010;123(24)：3634-9.

〔2015-10-20修回〕

(編輯滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.013

遼寧省自然基金資助項目(No.2013022007)

萬義增(1961-)，男，教授，碩士生導師，主要從事臨床病理學研究。

陳素賢(1972-)，女，教授，碩士生導師，主要從事臨床病理學研究。

R282

A

1005-9202(2016)14-3379-；