白　楊　王　虎　單　臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林　長春　130021)

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抑肽酶對白兔跟腱斷裂模型修復(fù)過程的影響

白楊王虎單臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林長春130021)

目的觀察抑肽酶對家兔跟腱斷裂修復(fù)過程的影響。方法選用60只新西蘭白兔，隨機分為3組，每組6只。正常組不予任何處理；模型組和治療組手術(shù)制作跟腱斷裂模型，治療組白兔在損傷周圍部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射1 ml，模型組每天注射等量生理鹽水。于造模后第3天及第1、2、3、4周進行標本采集，觀察跟腱斷裂部位的病理形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達。結(jié)果抑肽酶治療組術(shù)后纖維細胞增生較早(第3天可見)，炎性細胞少量浸潤，后期(2～4 w)膠原纖維排列較規(guī)則、緊密、成熟，而模型組炎性細胞浸潤時間長，膠原纖維排列不規(guī)則。TGF-β1表達量在術(shù)后第3天及第1周抑肽酶治療組高于模型組，但第2～4周時抑肽酶治療組中表達量明顯減少且低于模型組。結(jié)論抑肽酶可通過調(diào)控TGF-β1的表達量，減輕炎癥的反應(yīng)，促進膠原細胞的增生，對跟腱斷裂的修復(fù)有一定促進作用。

抑肽酶；跟腱斷裂；轉(zhuǎn)化生長因子-β1

跟腱斷裂是骨科常見的一種疾病，因其供血較差，易導(dǎo)致組織營養(yǎng)不良、退行性變以及壞死等并發(fā)癥，目前臨床主要是是保守治療及手術(shù)治療，但都不能避免并發(fā)癥的發(fā)生〔1，2〕。抑肽酶是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究表明，抑肽酶對肝、腦、心等多種組織的缺血再灌注損傷有明顯的保護作用〔3，4〕。但把抑肽酶應(yīng)用于骨科的研究報道甚少。本研究旨在探討局部注射抑肽酶的家兔跟腱斷裂恢復(fù)情況及可能機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物來自吉林大學實驗動物中心提供的新西蘭白兔，同月齡、體重為(2.8±0.2)kg。所有實驗動物在室溫20℃～28℃，相對濕度40%～70%的動物房內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2模型制備造模前12 h開始禁食，不禁水，直至實驗結(jié)束。將白兔固定于手術(shù)臺上，實施跟腱局部麻醉后，用手術(shù)刀切斷跟腱內(nèi)側(cè)1/2組織，使中央部分成“V”字缺損。跟腱周圍被膜絲線連續(xù)縫合，絲線間斷縫合皮膚。術(shù)后無菌紗布包扎傷口，并扎緊，防止脫落。每只家兔肌肉注射青霉素(1次/d，40萬U/次)，連續(xù)3 d。傷口不給予更換紗布，不給予夾板固定，給予籠外放養(yǎng)，自由活動。

1.3分組及方法取60只新西蘭白兔，隨機分為3組，正常組(不做任何處理)，模型組，抑肽酶治療組(制備模型縫合腱周膜后，損傷周圍部位注射抑肽酶，按10 000 kIU/ml注射，縫合皮膚)。模型組和抑肽酶組家兔皮膚傷口處愈合良好，未見感染。各組動物均能存活至實驗結(jié)束。

1.4病理觀察于造模后第3天及第1、2、3、4周取樣，將跟腱組織后置于10%甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成厚度為4 μm切片，進行HE染色，普通光學顯微鏡下觀察跟腱組織的病理變化。

1.5免疫組織化學染色于造模后，觀察跟腱斷裂部位的病理形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達，注射抑肽酶后第3天及第1、2、3、4周處死白兔，進行標本采集。固定于10%甲醛，經(jīng)石蠟包埋后，縱切厚4 μm標本，進行免疫組織化學檢測。

2　結(jié)　果

2.1各組家兔跟腱病理組織結(jié)構(gòu)的變化圖1，圖2可見，術(shù)后第3天，模型組斷面可見大量炎性細胞浸潤，纖維細胞較少，組織間水腫明顯；術(shù)后第1周，炎性細胞仍多見，膠原纖維少，排列雜亂；術(shù)后第2周斷面有肉芽組織形成，同時可見薄壁新生毛細血管生成；術(shù)后第3周炎性細胞少量浸潤，成纖維細胞數(shù)量增多，但未成熟細胞較多，細胞呈圓形或軟圓形部分；術(shù)后第4周，斷面可見瘢痕形成，膠原纖維排列不規(guī)則，可見少量的炎性細胞。

抑肽酶治療組術(shù)后第3天斷面附近有一定量的炎性細胞，纖維細胞可見，組織水腫不明顯；術(shù)后第1周，大量的成纖維細胞增生，膠原纖維多，炎性細胞少量浸潤；術(shù)后第2周，膠原纖維排列較規(guī)則，術(shù)后第3周時膠原纖維排列緊密，且縱向生長呈條索狀；術(shù)后第4周可見成熟呈梭型的纖維細胞，未見明顯炎性細胞。

2.2TGF-β1在抑肽酶對家兔跟腱斷裂模型跟腱修復(fù)中的表達TGF-β1在正常家兔跟腱有少量表達，而在模型組及抑肽酶治療組可見大量表達，主要在斷端組織中的炎性細胞、新生毛細血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞中表達；術(shù)后第3天及第1周抑肽酶治療組表達量高于模型組，但第2～4周時抑肽酶治療組中表達量明顯減少且低于模型組，見圖3，圖4。

圖2　治療組各時間點兔跟腱病理組織結(jié)構(gòu)變化(HE，×200)

圖3　正常組及模型組兔跟腱組織TGF-β1表達(DAB，×200)

圖4　治療組兔跟腱組織中TGF-β1的表達(DAB，×200)

3　討　論

跟腱斷裂是目前骨科學和運動醫(yī)學面臨的主要傷病之一。跟腱斷裂后可以導(dǎo)致膠原基質(zhì)和肌腱細胞的變化。組織病理學顯示，膠原變性，膠原纖維紊亂和稀疏，血管和細胞增多，肌腱細胞梭形結(jié)構(gòu)消失〔5〕。本研究說明成功地制造出家兔跟腱斷裂模型。 抑肽酶是一種廣譜非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，因其有很強的血小板保護作用，能減少術(shù)后出血量和縮短創(chuàng)面滲血時間〔6〕；而且抑肽酶通過抑制炎癥反應(yīng)介質(zhì)的釋放，預(yù)防細胞因子級聯(lián)反應(yīng)，減少細胞黏附、聚集反應(yīng)〔7〕，被廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療。近年來學者也嘗試把抑肽酶應(yīng)用于骨科疾病的治療。靳啟國〔8〕利用抑肽酶對各類蛋白酶均有不同程度的抑制作用，從而防止蛋白或肽類藥物的降解而增加其利用度〔9〕，把與適量抑肽酶與Ⅱ型膠原一起灌服給關(guān)節(jié)炎模型大鼠，得到抑肽酶可以增強Ⅱ型膠原的治療效果。但Brown等〔10〕報道在隨機對照試驗抑肽酶治療26例跟腱腱病中，在治療結(jié)果上沒有發(fā)現(xiàn)明顯的統(tǒng)計學差異，可能與其樣本量不足，所得結(jié)果缺乏意義有關(guān)。 本研究提示把抑肽酶局部注射到血液供應(yīng)較差的肌腱損傷處，可以減輕炎癥的反應(yīng)，促進膠原細胞的增生，對肌腱斷裂的修復(fù)有一定促進作用。

TGF-β是一組具有多功能的蛋白質(zhì)，在骨組織、血小板和軟骨組織中含量豐富。目前人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 3種類型的TGF-β，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β的生理功能主要是促進細胞增殖、分化，促進細胞外基質(zhì)分泌與合成，參與骨的重建等生理過程〔11〕。其中TGF-β1在近年來的實驗研究證實對肌腱的形成、生長及修復(fù)過程起著重要的作用，在老鼠跟腱局部予TGF-β1治療后可以提高Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA的表達〔12〕，用含有TGF-β1的多聚乳酸涂層的髓內(nèi)針固定大鼠脛骨骨折后，骨折愈合時間明顯縮短〔13〕。本實驗結(jié)果進一步驗證了TGF-β參與了跟腱愈合的整個過程。但在術(shù)后第3天至1 w時檢測發(fā)現(xiàn)，抑肽酶組的TGF-β1高于模型組，這種現(xiàn)象說明抑肽酶可以通過改變TGF-β1的提前表達加速跟腱組織的愈合，而在術(shù)后第2～4周時檢測發(fā)現(xiàn)，抑肽酶組的TGF-β1的表達量卻低于模型組，這一結(jié)果可能和TGF-β1在預(yù)防跟腱粘連方面有關(guān)。文獻報道，TGF-β1這種細胞因子的過度表達可以致瘢痕形成導(dǎo)致粘連，而適當?shù)囊种芓GF-β1表達，抑制膠原細胞的增生，減少膠原纖維的形成，從而抑制跟腱的外源性愈合機制，可以減少粘連的產(chǎn)生〔14〕。由此推測跟腱斷裂術(shù)后注射抑肽酶，后期TGF-β1表達下降，是通過抑制了跟腱的外源性愈合機制，進而轉(zhuǎn)化為依靠腱細胞自身的分化增殖的內(nèi)源性愈合機制促進跟腱的愈合，減輕了粘連，使跟腱更趨于成熟。

1Maffuli N，Kader D.Tendinopathy of tendo achillis〔J〕.J Bone Joint Surg (Br)，2002；84(1)：1.

2Hess GW.Achilles tendon rupture：a review of etiology，population，anatomy，risk factors，and injury prevention〔J〕.Foot Ankle Spec，2010；3(1)：29-32.

3Vande Vusse LK，Zacharski LR，Dumas MG，etal.Prohemostatic therapy：the rise and fall of aprotinin〔J〕.Semin Thromb Hemost，2010；36(1)：103-12.

4Edmunds LH Jr.Managing fibrinolysis without aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2010；89(1)：324-31.

5Fritschy D，Wallensten R.Surgical treatment of patellar tendinitis〔J〕.Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc，1993；1(2)：131-3.

6Ozer Z，Sudu N，Dusmez D，etal.The effect of aprotinin on ischemia-reperfusion injury in the rabbit kidney〔J〕.Pharmacol Res，2001；44(6)：455-60.

7Landis RC，Asimakopoulos G，Poullis M，etal.The antithrombotic and anti inflammatory mechanisms of action of aprotinin〔J〕.Ann Thorac Surg，2001；72(6)：2169-75.

8靳啟國.口服Ⅱ型膠原及抑肽酶對佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用研究〔J〕.泰山醫(yī)學院學報，2007；28(9)：677-80.

9Morishita M，Morishita I，Takayama K，etal.Hypoglycemic effect of novel oral microspheres of insulin with protease inhibitor in normal and diabetic rats〔J〕.Int J Pharm，1992；78(1)：9-16.

10Brown R，Orchard J，Kinchington M，etal.Aprotinin in the management of Achilles tendinopathy：a randomised controlled trial〔J〕.Br J Sports Med，2006；40(3)：275-9.

11Wildemann B，Schmidmaier G，Brenner N，etal.Quantification，ioealization，and expression of IGF-1 and TGF-beta 1 during growth factor stimulated fracture healing〔J〕.Galcif Tissue Int，2004；74(4)：388-97.

12Kashiwagi K，Mochizuki Y，Yasunaga Y，etal.Effects of transforming growth factor-β1 on the early stages of healing of the achilles tendon in a rat model〔J〕.J Plast Reconstr Surg Hand Surg，2004；38(2)：193-7.

13Schmidmaier G，Wildemann B，Ostapowicz D，etal.Long-term effects of local growth factor(IGF-1 and TGF-beta 1)treatment on fracture healing.A safety study for using growth factors〔J〕.J Orthop Res，2004；22(3)：514-9.

14Chang J，Thunder R，Most D，etal.Studies in flexor tendon wound healing：neutralizing antibody to TGF-bl increases postoperative range of motion〔J〕.Plast Reconstr Surg，2000；105(1)：148-55.

〔2015-12-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.008

吉林省自然科學基金項目(201215199)

單臣(1968-)，男，主任醫(yī)師，主要從事周圍神經(jīng)及軟組織損傷的研究。

白楊(1971-)，女，主管護師，主要從事護理及心理康復(fù)教育研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3368-03；