白　楊　王　虎　單　臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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抑肽酶對(duì)白兔跟腱斷裂模型修復(fù)過(guò)程的影響

白楊王虎單臣

(吉林省人民醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021)

目的觀察抑肽酶對(duì)家兔跟腱斷裂修復(fù)過(guò)程的影響。方法選用60只新西蘭白兔，隨機(jī)分為3組，每組6只。正常組不予任何處理；模型組和治療組手術(shù)制作跟腱斷裂模型，治療組白兔在損傷周?chē)课蛔⑸湟蛛拿?，?0 000 kIU/ml注射1 ml，模型組每天注射等量生理鹽水。于造模后第3天及第1、2、3、4周進(jìn)行標(biāo)本采集，觀察跟腱斷裂部位的病理形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)。結(jié)果抑肽酶治療組術(shù)后纖維細(xì)胞增生較早(第3天可見(jiàn))，炎性細(xì)胞少量浸潤(rùn)，后期(2～4 w)膠原纖維排列較規(guī)則、緊密、成熟，而模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)時(shí)間長(zhǎng)，膠原纖維排列不規(guī)則。TGF-β1表達(dá)量在術(shù)后第3天及第1周抑肽酶治療組高于模型組，但第2～4周時(shí)抑肽酶治療組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組。結(jié)論抑肽酶可通過(guò)調(diào)控TGF-β1的表達(dá)量，減輕炎癥的反應(yīng)，促進(jìn)膠原細(xì)胞的增生，對(duì)跟腱斷裂的修復(fù)有一定促進(jìn)作用。

抑肽酶；跟腱斷裂；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1

跟腱斷裂是骨科常見(jiàn)的一種疾病，因其供血較差，易導(dǎo)致組織營(yíng)養(yǎng)不良、退行性變以及壞死等并發(fā)癥，目前臨床主要是是保守治療及手術(shù)治療，但都不能避免并發(fā)癥的發(fā)生〔1，2〕。抑肽酶是一種廣譜絲氨酸蛋白酶抑制劑。研究表明，抑肽酶對(duì)肝、腦、心等多種組織的缺血再灌注損傷有明顯的保護(hù)作用〔3，4〕。但把抑肽酶應(yīng)用于骨科的研究報(bào)道甚少。本研究旨在探討局部注射抑肽酶的家兔跟腱斷裂恢復(fù)情況及可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的新西蘭白兔，同月齡、體重為(2.8±0.2)kg。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在室溫20℃～28℃，相對(duì)濕度40%～70%的動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)。

1.2模型制備造模前12 h開(kāi)始禁食，不禁水，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。將白兔固定于手術(shù)臺(tái)上，實(shí)施跟腱局部麻醉后，用手術(shù)刀切斷跟腱內(nèi)側(cè)1/2組織，使中央部分成“V”字缺損。跟腱周?chē)荒そz線(xiàn)連續(xù)縫合，絲線(xiàn)間斷縫合皮膚。術(shù)后無(wú)菌紗布包扎傷口，并扎緊，防止脫落。每只家兔肌肉注射青霉素(1次/d，40萬(wàn)U/次)，連續(xù)3 d。傷口不給予更換紗布，不給予夾板固定，給予籠外放養(yǎng)，自由活動(dòng)。

1.3分組及方法取60只新西蘭白兔，隨機(jī)分為3組，正常組(不做任何處理)，模型組，抑肽酶治療組(制備模型縫合腱周膜后，損傷周?chē)课蛔⑸湟蛛拿?，?0 000 kIU/ml注射，縫合皮膚)。模型組和抑肽酶組家兔皮膚傷口處愈合良好，未見(jiàn)感染。各組動(dòng)物均能存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.4病理觀察于造模后第3天及第1、2、3、4周取樣，將跟腱組織后置于10%甲醛溶液中固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成厚度為4 μm切片，進(jìn)行HE染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察跟腱組織的病理變化。

1.5免疫組織化學(xué)染色于造模后，觀察跟腱斷裂部位的病理形態(tài)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1表達(dá)，注射抑肽酶后第3天及第1、2、3、4周處死白兔，進(jìn)行標(biāo)本采集。固定于10%甲醛，經(jīng)石蠟包埋后，縱切厚4 μm標(biāo)本，進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)。

2　結(jié)　果

2.1各組家兔跟腱病理組織結(jié)構(gòu)的變化圖1，圖2可見(jiàn)，術(shù)后第3天，模型組斷面可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維細(xì)胞較少，組織間水腫明顯；術(shù)后第1周，炎性細(xì)胞仍多見(jiàn)，膠原纖維少，排列雜亂；術(shù)后第2周斷面有肉芽組織形成，同時(shí)可見(jiàn)薄壁新生毛細(xì)血管生成；術(shù)后第3周炎性細(xì)胞少量浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，但未成熟細(xì)胞較多，細(xì)胞呈圓形或軟圓形部分；術(shù)后第4周，斷面可見(jiàn)瘢痕形成，膠原纖維排列不規(guī)則，可見(jiàn)少量的炎性細(xì)胞。

抑肽酶治療組術(shù)后第3天斷面附近有一定量的炎性細(xì)胞，纖維細(xì)胞可見(jiàn)，組織水腫不明顯；術(shù)后第1周，大量的成纖維細(xì)胞增生，膠原纖維多，炎性細(xì)胞少量浸潤(rùn)；術(shù)后第2周，膠原纖維排列較規(guī)則，術(shù)后第3周時(shí)膠原纖維排列緊密，且縱向生長(zhǎng)呈條索狀；術(shù)后第4周可見(jiàn)成熟呈梭型的纖維細(xì)胞，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞。

2.2TGF-β1在抑肽酶對(duì)家兔跟腱斷裂模型跟腱修復(fù)中的表達(dá)TGF-β1在正常家兔跟腱有少量表達(dá)，而在模型組及抑肽酶治療組可見(jiàn)大量表達(dá)，主要在斷端組織中的炎性細(xì)胞、新生毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中表達(dá)；術(shù)后第3天及第1周抑肽酶治療組表達(dá)量高于模型組，但第2～4周時(shí)抑肽酶治療組中表達(dá)量明顯減少且低于模型組，見(jiàn)圖3，圖4。

圖2　治療組各時(shí)間點(diǎn)兔跟腱病理組織結(jié)構(gòu)變化(HE，×200)

圖3　正常組及模型組兔跟腱組織TGF-β1表達(dá)(DAB，×200)

圖4　治療組兔跟腱組織中TGF-β1的表達(dá)(DAB，×200)

3　討　論

跟腱斷裂是目前骨科學(xué)和運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)面臨的主要傷病之一。跟腱斷裂后可以導(dǎo)致膠原基質(zhì)和肌腱細(xì)胞的變化。組織病理學(xué)顯示，膠原變性，膠原纖維紊亂和稀疏，血管和細(xì)胞增多，肌腱細(xì)胞梭形結(jié)構(gòu)消失〔5〕。本研究說(shuō)明成功地制造出家兔跟腱斷裂模型。 抑肽酶是一種廣譜非特異性絲氨酸蛋白酶抑制劑，因其有很強(qiáng)的血小板保護(hù)作用，能減少術(shù)后出血量和縮短創(chuàng)面滲血時(shí)間〔6〕；而且抑肽酶通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)介質(zhì)的釋放，預(yù)防細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，減少細(xì)胞黏附、聚集反應(yīng)〔7〕，被廣泛用于體外循環(huán)的心血管手術(shù)和多種疾病的治療。近年來(lái)學(xué)者也嘗試把抑肽酶應(yīng)用于骨科疾病的治療。靳啟國(guó)〔8〕利用抑肽酶對(duì)各類(lèi)蛋白酶均有不同程度的抑制作用，從而防止蛋白或肽類(lèi)藥物的降解而增加其利用度〔9〕，把與適量抑肽酶與Ⅱ型膠原一起灌服給關(guān)節(jié)炎模型大鼠，得到抑肽酶可以增強(qiáng)Ⅱ型膠原的治療效果。但Brown等〔10〕報(bào)道在隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)抑肽酶治療26例跟腱腱病中，在治療結(jié)果上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能與其樣本量不足，所得結(jié)果缺乏意義有關(guān)。 本研究提示把抑肽酶局部注射到血液供應(yīng)較差的肌腱損傷處，可以減輕炎癥的反應(yīng)，促進(jìn)膠原細(xì)胞的增生，對(duì)肌腱斷裂的修復(fù)有一定促進(jìn)作用。

TGF-β是一組具有多功能的蛋白質(zhì)，在骨組織、血小板和軟骨組織中含量豐富。目前人體內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 3種類(lèi)型的TGF-β，即TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3。TGF-β的生理功能主要是促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)分泌與合成，參與骨的重建等生理過(guò)程〔11〕。其中TGF-β1在近年來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)對(duì)肌腱的形成、生長(zhǎng)及修復(fù)過(guò)程起著重要的作用，在老鼠跟腱局部予TGF-β1治療后可以提高Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA的表達(dá)〔12〕，用含有TGF-β1的多聚乳酸涂層的髓內(nèi)針固定大鼠脛骨骨折后，骨折愈合時(shí)間明顯縮短〔13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了TGF-β參與了跟腱愈合的整個(gè)過(guò)程。但在術(shù)后第3天至1 w時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑肽酶組的TGF-β1高于模型組，這種現(xiàn)象說(shuō)明抑肽酶可以通過(guò)改變TGF-β1的提前表達(dá)加速跟腱組織的愈合，而在術(shù)后第2～4周時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抑肽酶組的TGF-β1的表達(dá)量卻低于模型組，這一結(jié)果可能和TGF-β1在預(yù)防跟腱粘連方面有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，TGF-β1這種細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)可以致瘢痕形成導(dǎo)致粘連，而適當(dāng)?shù)囊种芓GF-β1表達(dá)，抑制膠原細(xì)胞的增生，減少膠原纖維的形成，從而抑制跟腱的外源性愈合機(jī)制，可以減少粘連的產(chǎn)生〔14〕。由此推測(cè)跟腱斷裂術(shù)后注射抑肽酶，后期TGF-β1表達(dá)下降，是通過(guò)抑制了跟腱的外源性愈合機(jī)制，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為依靠腱細(xì)胞自身的分化增殖的內(nèi)源性愈合機(jī)制促進(jìn)跟腱的愈合，減輕了粘連，使跟腱更趨于成熟。

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〔2015-12-25修回〕

(編輯李相軍/滕欣航)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.008

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201215199)

單臣(1968-)，男，主任醫(yī)師，主要從事周?chē)窠?jīng)及軟組織損傷的研究。

白楊(1971-)，女，主管護(hù)師，主要從事護(hù)理及心理康復(fù)教育研究。

R3

A

1005-9202(2016)14-3368-03；