張忠立　左月明

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西　南昌　330004)

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延齡草提取物對異質(zhì)性及多因性阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶與抗氧化能力的影響

張忠立左月明

(江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌330004)

目的探討延齡草提取物對異質(zhì)性及多因性阿爾茨海默病(H/MAD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶與抗氧化能力的影響。方法先腹腔注射D-半乳糖促衰老，再反復(fù)結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈致腦缺血，最后大鼠側(cè)腦室一次性注射Aβ1～40制備H/MAD模型。實驗設(shè)空白組，H/MAD模型組，鹽酸多奈哌齊組，延齡草總提物高、中劑量組，水洗脫物高、中劑量組，30%乙醇洗脫物高、中劑量組，60%乙醇洗脫物高、中劑量組，85%乙醇洗脫物高中劑量組。各給藥組于術(shù)后3 d開始灌胃給藥6 d。采用Morris水迷宮測試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，并測定大鼠血清中總抗氧化物(T-AOC)、乙酰膽堿酯酶(TChE)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力。結(jié)果與模型組比較，給藥各組能明顯縮短潛伏期、增加過臺次數(shù)、在第四象限逗留時間延長，并使大鼠血清中T-AOC含量升高、降低TChE活力，提高SOD、GSH-Px的活性，降低MDA含量(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論延齡草提取物(尤其是85%乙醇洗脫物中劑量、60%乙醇洗脫物高劑量)對H/MAD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶有明顯的改善作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)T-AOC活力、降低TChE含量及提高H/MAD大鼠的抗氧化作用相關(guān)。

延齡草提取物；異質(zhì)性及多因性阿爾茨海默病(H/MAD)；學(xué)習(xí)記憶；抗氧化能力

延齡草是傳統(tǒng)的名貴中藥，為百合科植物延齡草TrilliumtschonoskiiMaxim.的干燥根及根莖，味甘、性平，有小毒，具有延年益壽的功效〔1，2〕。主治頭暈?zāi)垦?、跌打損傷、神經(jīng)衰弱、腦震蕩后遺癥等疾病，是恩施土家族著名民間藥之一〔2〕。現(xiàn)代藥理研究表明，其具有抗氧化、抗衰老、降血壓、抗炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫等作用〔3～5〕。筆者先期建立了異質(zhì)性及多因性阿爾茨海默病(H/MAD)模型，本文在此基礎(chǔ)上研究延齡草提取物對H/MAD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和抗氧化能力的影響，初步探討延齡草抗氧化、防衰老和改善學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康SD雄性大鼠156只，體重350～400 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證編號為SCXK(湘)2012-0005。

1.2主要藥物及試劑延齡草70%乙醇總提取物(1 g相當(dāng)于生藥6.7 g)，經(jīng)大孔吸附樹脂分離的水洗脫物(1 g相當(dāng)于生藥12.2 g)、30%乙醇洗脫物(1 g相當(dāng)于生藥83.3 g)、60%乙醇洗脫物(1 g相當(dāng)于生藥55.6 g)、85%乙醇洗脫物(1 g相當(dāng)于生藥26.7 g)由本實驗室自行制備；鹽酸多奈哌齊購于衛(wèi)材藥業(yè)有限公司；D-半乳糖(Sigma公司)；β淀粉樣蛋白(Aβ)1～40(Sigma公司)；總抗氧化物(T-AOC)、乙酰膽堿酯酶(TChE)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3主要儀器ZS-B型腦立體定位儀、Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司)，UV-1800型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

1.4動物造模及分組處理156只健康SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組，H/MAD模型組，鹽酸多奈哌齊組，延齡草總提物高、中劑量組，水洗脫物高、中劑量組，30%乙醇洗脫物高、中劑量組，60%乙醇洗脫物高、中劑量組，85%乙醇洗脫物高、中劑量組，每組12只?？瞻捉M不予處理。模型組與給藥組每天腹腔注射D-半乳糖，4 w后先進(jìn)行雙側(cè)頸總動脈反復(fù)結(jié)扎間斷性阻斷血流，造成腦缺血性病灶，術(shù)后，取未死亡的狀態(tài)良好的大鼠再予腦內(nèi)注射凝聚態(tài)Aβ1～40〔6〕。造模術(shù)后第3天，模型組開始灌胃2%聚山梨酯水溶液6 d，1次/d；給藥組開始連續(xù)灌胃給藥6 d，1次/d。末次給藥后，測定大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能及血清中的各項生化指標(biāo)。

1.5Morris水迷宮實驗預(yù)先在水池里注入墨水使水面高出平臺1～2 cm，水池分為4個象限。將平臺放在第四象限中間，在其他三個象限任選一點面向水池池壁將大鼠放入水中，實驗歷時5 d，訓(xùn)練4 d，第5天將平臺移走，每只大鼠游1 min，記錄每只大鼠第一次經(jīng)過原平臺的時間(潛伏期)、每只大鼠在1 min內(nèi)經(jīng)過平臺的次數(shù)，計算每只大鼠在第四象限游泳的時間(t4)占整個游泳時間(t總)的百分比和在第四象限游泳的距離(I4)占整個游泳距離(I總)的百分比〔6〕。

1.6各生化指標(biāo)測定與方法大鼠水迷宮實驗結(jié)束后，心臟采血，離心后取血清，按試劑盒說明書測定血清T-AOC、TChE、SOD、MDA、GSH-Px等水平。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SAS9.3軟件行單因素方差分析或最小顯著差法檢驗。

2　結(jié)　果

2.1延齡草提取物對Morris水迷宮實驗結(jié)果的影響與空白組比較，模型組大鼠潛伏期延長、過臺次數(shù)減少，在第四象限逗留時間和距離短(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組、延齡草提取物各組能縮短潛伏期、增加過臺次數(shù)，在第四象限逗留時間和距離延長(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脫物中劑量組、60%乙醇洗脫物高劑量組和水洗脫物中劑量組效果更明顯。見表1。

表1　延齡草提取物對H/MAD模型大鼠空間探索能力的影響±s，n=10)

與空白組比較：1)P<0.01；與H/MAD模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.2延齡草提取物對H/MAD模型大鼠血清中T-AOC和TChE含量的影響與空白組比較，模型組大鼠血清中T-AOC含量降低，TChE活力增強(qiáng)(P<0.01)；給藥各組能提高T-AOC含量，降低TChE活力，與模型組相比具有顯著差異(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脫物中劑量組、60%乙醇洗脫物高劑量組治療效果更明顯。見表2。

2.3延齡草提取物對H/MAD模型大鼠血清中SOD、MDA和GSH-Px含量的影響與空白組比較，模型組大鼠SOD、GSH-Px明顯降低(P<0.01)，而MDA水平顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組可使MDA水平下降(P<0.05)，提高SOD、GSH-Px的活力(P<0.01)；與模型組比較，延齡草提取物各組能使MDA水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)，而SOD、GSH-Px明顯上升(P<0.05或P<0.01)，尤其是85%乙醇洗脫物中劑量組、60%乙醇洗脫物高劑量組效果更明顯。見表2。

表2　延齡草提取物對H/MAD模型大鼠血清中T-AOC和TChE、SOD、MDA、GSH-Px含量的影響

3　討　論

本實驗采用H/MAD藥物篩選模型，通過Morris水迷宮實驗檢測動物行為學(xué)改變顯示造模成功。AD患者腦組織神經(jīng)元細(xì)胞中存在明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。正常情況下，體內(nèi)存在一套有效的抗氧化防御系統(tǒng)，能及時清除過量的自由基，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整。病理情況下，機(jī)體產(chǎn)生的自由基超過機(jī)體的清除能力，促使疾病進(jìn)一步發(fā)展。T-AOC是機(jī)體抗氧化能力的總體評價指標(biāo)，其水平可反映機(jī)體抗氧化系統(tǒng)對外來刺激的代償能力及機(jī)體自由基代謝的狀態(tài)〔7〕。TChE是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水解酶，直接參與自主神經(jīng)功能調(diào)節(jié)、大腦思維、記憶等功能〔8〕。SOD能特異性結(jié)合體內(nèi)超氧陰離子，可直接捕捉和清除超氧陰離子等自由基，催化超氧陰離子生成過氧化氫和氧分子，阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈〔7〕。GSH-Px是重要的過氧化物分解酶，與SOD協(xié)同作用清除機(jī)體過多的自由基和過氧化物〔9〕。而MDA含量的變化可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷的程度〔10〕。本實驗結(jié)果顯示，H/MAD模型組大鼠腦組織內(nèi)自由基產(chǎn)生增加，發(fā)生了明顯的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。延齡草提取物能使模型大鼠血清中T-AOC的活力恢復(fù)，明顯提高SOD、GSH-Px的活力，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力；降低TChE、MDA的含量，以減少機(jī)體受自由基損傷的程度，表現(xiàn)出良好的抗氧化損傷作用。由此可知，延齡草提取物(尤其是85%乙醇洗脫物中劑量、60%乙醇洗脫物高劑量)可通過有效清除氧自由基、提高機(jī)體的抗氧化能力提高模型動物的學(xué)習(xí)記憶能力，對AD的發(fā)生發(fā)展起到一定的防治作用。

1中國科學(xué)院武漢植物所.湖北植物志〔M〕.第4冊.武漢：湖北科技出版社，2003：453.

2方志先，朱詩立.恩施州民族醫(yī)藥研究叢書·恩施本草精選〔M〕.北京：國際文化出版公司，2002：302.

3肖本見，陳國棟，譚志鑫，等.頭頂一棵珠抗炎和免疫作用的實驗研究〔J〕.安徽醫(yī)藥，2005；9(4)：246-8.

4黃麗亞，葉嗣穎.延齡草續(xù)斷上調(diào)抗氧化酶表達(dá)作用的比較研究〔J〕.遼寧中醫(yī)雜志，2006；33(8)：1012-3.

5喻玲玲，鄒坤，汪鋆植，等.延齡草提取物抗炎、鎮(zhèn)痛和凝血作用的研究〔J〕.時珍國醫(yī)國藥，2008；19(5)：1178-80.

6左月明，張忠立，楊炳友，等.黑水纈草抗老年癡呆活性部位的研究〔J〕.中藥新藥與臨床藥理，2010；21(1)：15-8.

7馬寶慧，高永勝，潘桂蘭，等.木樨草素對高脂血癥模型大鼠血漿一氧化氮水平與抗氧化能力的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2014；34(8)：2176-8.

8尤力都孜·買買提，熱比姑麗·伊斯拉木，艾西木江·熱甫卡提閆明，等.新疆曼陀羅子對大鼠組織勻漿單胺氧化酶及乙酰膽堿酯酶的影響〔J〕.中國藥業(yè)，2012；21(23)：4-5.

9劉玲飛，陳文材，劉佳微，等.芹菜素處理雄性大鼠肝、腦、睪丸、腎和血清某些生化指標(biāo)的變化〔J〕.毒理學(xué)雜志，2014；28(3)：227-30.

10王傳鵬，楊超，趙駿，等.芹菜素對雄性小鼠肝臟SOD、GSH-Px、CAT活力影響〔J〕.中國實用醫(yī)藥，2013；8(6)：21-2.

〔2015-12-19修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of extracts from Trillium tschonoskii on spatial learning memory and antioxidant capacity in rat model of heterogeneity/multi-factors′ Alzheimer′s disease

ZHANG Zhong-Li，ZUO Yue-Ming.

College of Pharmacy,Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004,Jiangxi,China

ObjectiveTo screen effect of extracts from Trillium tschonoskii on spatial learning memory and antioxidant capacity in rat model of heterogeneity/multi-factors′ Alzheimer′s disease(H/MAD).MethodsThe experiment was set normal control,H/MAD model,Aricept groups,high and middle dose groups of total extract of Trillium tschonoskii,water elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,30% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,60% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii,85% ethanol elution high and middle dose groups of Trillium tschonoskii.Morris water maze was applied to test the spatial learning memory ability.Meanwhile,plasma contents of T-AOC,TChE,SOD,MDA and GSH-Px were detected.ResultsCompared with that of model group,the incubating period of drug delivery groups were reduced，through the platform times were increased，stay time in the fourth quadrant were extended，and the content of T-AOC were increased，TChE in serum vitality were reduced,SOD and GSH-Px in serum activity were increased,the level of MDA in serum content were decreased(P<0.05,P<0.01).ConclusionsThe extract of Trillium tschonoskii(especially 85% ethanol elution middle dose and 60% ethanol elution high dose)has obviously improvement effect on spatial learning memory in H/MAD model rats,its mechanism might be associated with the enhance of T-AOC activity and lower TChE content,effectively inhibit the lipid peroxide and remove excess free radicals in the body,significantly improve the antioxidant capacity of H/MAD rats.

Trillium tschonoskii extract;Heterogeneitys/Multi-factors'Alzheimer's disease;Learning memory;Antioxidant capacity

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.006

國家自然科學(xué)基金項目(81260631)

左月明(1978-)，女，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物資源的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)制研究。

張忠立(1979-)，男，副教授，碩士，主要從事天然藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)14-3362-03；