王琳琳　白　莉

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南　鄭州　450046)

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車前草總黃酮對大鼠前列腺增生的治療作用及機(jī)制

王琳琳白莉

(河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南鄭州450046)

目的探討車前草總黃酮對大鼠前列腺增生(BPH)的治療作用及機(jī)制。方法清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、法舒地爾組、車前草總黃酮低、中、高劑量組(n=8)。除對照組外，其余各組大鼠皮下注射丙酸睪酮(7.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)10 d)復(fù)制BPH模型，車前草總黃酮組分別給予車前草總黃酮灌胃治療(分別給予1 mg/kg、10 mg/kg和50 mg/kg灌胃，1次/d，持續(xù)60 d)，法舒地爾組給予法舒地爾(5 mg/kg，1次/d，持續(xù)60 d)灌胃治療。分析各組大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)、RhoA/ROCK通路蛋白及細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)。結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)前列腺增生大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)水平明顯升高，促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明顯升高而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低，RhoA-ROCK1/2和腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)明顯升高而轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β表達(dá)明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標(biāo)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。結(jié)論車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

前列腺增生；車前草總黃酮；法舒地爾；RhoA/ROCK信號通路；細(xì)胞凋亡

前列腺增生(BPH)主要表現(xiàn)為尿頻、尿急、尿失禁和夜尿增多等，但發(fā)病與吸煙、酗酒、年齡增長等相關(guān)，但是其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確〔1〕。RhoA/Rho激酶(ROCK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且與多種生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)〔2〕。本研究旨在分析BPH的發(fā)病機(jī)制及車前草總黃酮的干預(yù)作用。

1　材料與方法

1.1儀器垂直電泳儀購自ABI公司(MINI-PROTEAN TETRA CELL)；半干轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一儀器廠(TE70XP)；全波長酶標(biāo)儀購自賽默飛世爾(Multiskan Spectrum型)；全自動生化分析儀購自羅氏公司(MODULE P800)；組織勻漿儀購自Roche Applied Science(MagNA Lyser)。

1.2藥品與試劑丙酸睪酮注射液(1 ml：25 mg)購自科倫藥業(yè)(國藥準(zhǔn)字H40123555)；總蛋白提取試劑盒(Lot20141017)及蛋白定量試劑盒(Lot20141124)購自南京建成生物工程研究中心；半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3蛋白檢測試劑盒購自O(shè)mega公司；Caspase-9蛋白檢測試劑盒購自R&D公司；Bax和Bcl-2蛋白檢測試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α蛋白檢測試劑盒購自Elab Science公司；RhoA蛋白檢測試劑盒購自美國BIOO公司；ROCK1/2蛋白檢測試劑盒購自Abcam公司。所有操作過程均按照說明書進(jìn)行。

1.3動物清潔級雄性SD大鼠48只，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物中心，許可證號SCXK(滬)20080033，大鼠體重210～230 g，均在恒溫(23℃±2℃)恒濕(55%±5%)條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，期間自由飲食。

1.4模型復(fù)制除對照組外，其余各組大鼠給予一次性皮下注射丙酸睪酮(3 mg·kg-1·d-1)，對照組進(jìn)行皮下注射等劑量的精制麻油。7 d后車前草總黃酮組和法舒地爾組分別給予車前草總黃酮(低劑量組：1 mg/kg；中劑量組5 mg/kg；高劑量組：10 mg/kg)和法舒地爾(5 mg/kg)灌胃治療，對照組和模型組給予等劑量的溶劑(CMC-Na)灌胃。連續(xù)灌胃30 d后頸動脈放血處死動物。

1.5觀察指標(biāo)本研究分析BPH大鼠前列腺指數(shù)變化，前列腺組織中細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3、Caspse-9及Bax/Bcl-2表達(dá)；檢測RhoA/ROCK通路蛋白RhoA及ROCK1和ROCK2蛋白表達(dá)；分析組織中TNF-α及轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β蛋白變化。

1.6免疫印跡法組織于冰水浴中勻漿后進(jìn)行蛋白定量。以等量總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠(SDS-PAGE)電泳，待溴酚藍(lán)移至凝膠下端后停止電泳。半干法轉(zhuǎn)膜2 h，然后將纖維素膜用5.0%脫脂牛奶封閉1 h。無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)后與一抗4℃條件下雜交孵育4 h；無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)，然后與二抗雜交孵育4 h，無菌磷酸緩沖液沖洗3次(10 min/次)。然后進(jìn)行顯色、定影，并計(jì)算光密度。以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行蛋白分子的相對表達(dá)計(jì)算。

1.7前列腺濕重及指數(shù)分析大鼠灌胃治療24 h后稱取大鼠體重，頸動脈放血處死后分離大鼠前列腺，并沉重，計(jì)算前列腺指數(shù)。前列腺指數(shù)=前列腺濕重(mg)/大鼠體重(g)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1前列腺濕重及前列腺指數(shù)變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺濕重及前列腺指數(shù)水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標(biāo)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見表1。

2.2細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織促進(jìn)凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及Bax蛋白水平明顯高于對照組而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述指標(biāo)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見表2。

表1　前列腺濕重及前列腺指數(shù)變化及車前草總黃酮的改善作用±s,n=8)

與對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與車前草總黃酮高劑量組比較：3)P<0.01；下表同

表2　細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用分析±s,n=8)

2.3RhoA蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織RhoA蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述RohA蛋白表達(dá)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見圖1。

2.4ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織ROCK1和ROCK2蛋白水平明顯高于對照組(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述ROCK1及ROCK2蛋白表達(dá)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)，見圖2。

2.5TGF-β及TNF-α蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用BPH大鼠前列腺組織TNF-α蛋白水平明顯高于對照組而TGF-β蛋白水平明顯降低(P<0.01)；而車前草總黃酮能夠有效改善上述蛋白表達(dá)的異常(P<0.01)，且高劑量組比中劑量和低劑量組效果更顯著(P<0.01)。見圖3。

圖1　RhoA蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用

圖2　ROCK1、ROCK2蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用

圖3　TGF-β及TNF-α蛋白表達(dá)變化及車前草總黃酮的改善作用

3　討　論

BPH已成為影響老年人健康和生活治療的主要疾病之一，但是其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確。本研究表明車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

RhoA/ROCK通路異常參與了多種病理過程的發(fā)生及發(fā)展過程，且可能是藥物干預(yù)治療的潛在靶點(diǎn)〔3〕。在研究辛伐他汀通過Rho/Rho激酶信號通路抑制高血壓模型大鼠的心血管重構(gòu)的研究中發(fā)現(xiàn)異常的RhoA蛋白信號通路與大鼠心血管重構(gòu)密切相關(guān)，而辛伐他汀能夠通過抑制該通路改善高血壓大鼠的血管重構(gòu)過程〔4〕。在研究miR-146a通過抑制ROCK1基因的表達(dá)促進(jìn)去勢抵抗性前列腺癌細(xì)胞凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞凋亡過程與ROCK1蛋白的表達(dá)變化密切相關(guān)，且ROCK2 siRNA能夠?qū)ψ园l(fā)性高血壓大鼠勃起功能產(chǎn)生明顯的影響〔5〕。本研究表明ROCK信號通路參與了大鼠前列腺的增生過程，且可以作為藥物治療的靶點(diǎn)。細(xì)胞凋亡是由細(xì)胞凋亡蛋白參與、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要過程。以往的研究證實(shí)益腎通膠囊治療后BPH患者前列腺組織中促凋亡蛋白明顯升高而抑凋亡蛋白的表達(dá)明顯降低，即細(xì)胞凋亡過程參與了BPH患者前列腺異常過程〔6〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)A1蛋白與前列腺特異性抗原對前列腺癌與BPH臨床診斷具有重要的參考價(jià)值〔7〕。方志啟等〔8〕也發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax的表達(dá)與BPH的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后密切相關(guān)。本研究也表明細(xì)胞凋亡過程也參與了大鼠BPH過程，且可作為車前草總黃酮的作用靶點(diǎn)。

炎癥反應(yīng)參與了細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的病理過程，且與前列腺的多種病理過程密切相關(guān)。在研究水飛薊賓磷脂復(fù)合物對大鼠自身免疫性前列腺炎炎性細(xì)胞因子影響的研究中發(fā)現(xiàn)大鼠自身免疫性前列腺炎的發(fā)生與機(jī)體內(nèi)炎癥反應(yīng)因子水平異常相關(guān)，且藥物可通過改善炎癥反應(yīng)發(fā)揮治療作用〔9〕。以往的研究也發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸貝母苦參煎劑能通過調(diào)節(jié)TNF-α的異常表達(dá)對實(shí)驗(yàn)性慢性細(xì)菌性前列腺炎發(fā)揮治療作用〔10〕，且白細(xì)胞介素(IL)-10和TNF-α在BPH及前列腺癌的臨床診斷中具有重要的參考價(jià)值〔11〕。王磊等〔12〕也證實(shí)合并組織學(xué)炎癥的BPH組織中IL-6、TNF-α表達(dá)存在明顯的異常，且可作為臨床診斷的重要標(biāo)志物。本研究表明TNF-α、TGF-β也與大鼠BPH過程密切相關(guān)。因此，車前草總黃酮能夠通過抑制RhoA/ROCK通路蛋白和細(xì)胞凋亡過程發(fā)揮改善丙酸睪酮引起的大鼠BPH病理過程。

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6潘恩山,李煜罡.益腎通膠囊治療后BPH患者前列腺組織中促凋亡蛋白、抑凋亡蛋白的表達(dá)變化〔J〕.山東醫(yī)藥,2014；54(47):71-3.

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12王磊,劉致中,楊磊,等.合并組織學(xué)炎癥的前列腺增生組織中IL-6、TNF-α表達(dá)的研究〔J〕.臨床泌尿外科雜志,2014;29(9):787-90.

〔2015-12-11修回〕

(編輯袁左鳴)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.005

河南省高校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(No.16A350017)

王琳琳(1983-)，女，碩士，講師，主要從事中藥及活性成分藥效學(xué)研究。

R285

A

1005-9202(2016)14-3359-04；