陳　銳　胡志希　聶海洋　張洪娜　胡志希

(長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林　長春　130117)

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血管緊張素Ⅱ?qū)δI小球系膜細(xì)胞增殖的影響及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白-1的干預(yù)作用

陳銳胡志希1聶海洋2張洪娜3胡志希3

(長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，吉林長春130117)

目的探討血管緊張素(Ang)Ⅱ?qū)δI小球系膜細(xì)胞(HMC)增殖的影響及細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)-1的干預(yù)作用。方法體外培養(yǎng)HMC細(xì)胞，MTT法檢測AngⅡ有效作用濃度，ELISA法檢測白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β的含量，Western印跡法測定腎組織SOCS-1表達(dá)，確定SOCS-1的干預(yù)作用。結(jié)果AngⅡ作用于HMC細(xì)胞后，吸光度值(OD值)明顯增加(P<0.05)，10-6mol/ml AngⅡ在48 h作用最明顯(P<0.01)。SOCS-1可以抑制HMC細(xì)胞增殖，降低IL-6和IL-1β水平，與AngⅡ組比較有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論AngⅡ可誘導(dǎo)HMC細(xì)胞增殖，10-6mol/ml在48 h作用最明顯；SOCS-1可以降低HMC細(xì)胞分泌IL-6和IL-1β的含量，抑制HMC細(xì)胞增殖，從而延緩與減輕腎小球硬化，減緩疾病進(jìn)展。

SOCS-1；血管緊張素Ⅱ；腎小球系膜細(xì)胞；干預(yù)

糖尿病(DM)腎病(DN)是DM的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致死亡的重要原因；其微血管病變導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。腎小球系膜細(xì)胞(HMC)的過度增殖是導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化及腎小球硬化的重要原因。研究表明，血管緊張素(Ang)Ⅱ破壞腎小管的生理平衡引發(fā)DN〔1〕，腎小球系膜細(xì)胞分泌大量白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-1β，他們也是導(dǎo)致DN的主要因素〔2〕。因此，抑制HMC細(xì)胞的增殖和干預(yù)AngⅡ、IL-6、IL-1β的表達(dá)對于延緩與治療DN意義重大。

1　材料與方法

1.1材料(1)細(xì)胞：人HMC(上海復(fù)祥生物)。(2)試劑：胰蛋白酶、AngⅡ、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)；DMEM/F12培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清(Hyclone公司)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，北京鼎國昌盛生物公司)；兔抗細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制蛋白(SOCS)-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；ELISA試劑盒(上海朗頓生物公司)

1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器酶標(biāo)儀(Rayto公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；倒置熒光顯微鏡(上海比目儀器公司)；高速微能冷凍離心機(jī)3H24RI(湖南赫西)；精密電子天平(德國賽多利斯)；智能鼓風(fēng)干燥箱DHG-9053A(上海和呈)；智能超凈臺(蘇州凈化)。

1.3方法

1.3.1AngⅡ有效作用濃度篩選HMC細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中生長，長滿后將其接種于96孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱CO2濃度為5%，培養(yǎng)溫度為37℃。HMC于12 h后貼壁，更換培養(yǎng)液，24 h后細(xì)胞培育完成。分組：①對照組：正常HMC細(xì)胞組；②AngⅡ組：低濃度組10-8mol/ml，中濃度組10-7mol/ml，高濃度組10-6mol/ml；③空白調(diào)零組：無HMC細(xì)胞。反應(yīng)時間分別為24、48 h，5 mg/ml的MTT 20 μl加入96孔板中，孵育于培養(yǎng)箱中，4 h后清除上清液。在96孔板中加入DMSO 150 μl，經(jīng)10 min充分振蕩，待其溶解充分后，記錄波長492 nm下的酶標(biāo)儀OD值。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.2SOCS-1抑制HMC細(xì)胞的增殖將實(shí)驗(yàn)分為6組:①對照組：正常培養(yǎng)細(xì)胞；②AngⅡ組：AngⅡ(10-6mol/ml)；③SOCS-1低劑量組(5 mg/ml，S1)+AngⅡ；④SOCS-1中劑量組(10 mg/ml，S2)+AngⅡ；⑤SOCS-1高劑量組(20 mg/ml，S3)+AngⅡ；⑥空白調(diào)零組：無HMC細(xì)胞。5%脫脂奶粉稀釋兔抗體SOCS-1作用24、48 h，加入5 mg/ml的MTT 20 μl，在培養(yǎng)箱中孵育，4 h后清除上清液。同時計算出細(xì)胞生長抑制率。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.3ELISA法檢測IL-6、IL-1β的含量實(shí)驗(yàn)分成6組，具體同1.3.2，嚴(yán)格按照說明書采用ELISA法進(jìn)行IL-1β、IL-6含量的檢測。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2　結(jié)　果

2.1AngⅡ?qū)MC細(xì)胞的誘導(dǎo)作用AngⅡ最佳誘導(dǎo)濃度為10-6mol/ml，作用48 h最明顯(P<0.01)。見表1。

表1　AngⅡ?qū)MC細(xì)胞的最佳誘導(dǎo)濃度值)

與對照組比較:1)P<0.05，2)P<0.01

2.2SOCS-1有明顯抑制AngⅡ誘導(dǎo)HMC細(xì)胞增殖的作用見表2。與AngⅡ組及對照組比較，S1、S2、S3組對HMC細(xì)胞的增殖均有明顯抑制作用(P<0.01)，其中S3組48 h抑制效果最佳。

2.3SOCS-1明顯抑制HMC細(xì)胞IL-6、IL-1β含量與AngⅡ組比較，SOCS-1三個劑量組均有抑制HMC細(xì)胞分泌IL-6、IL-1β的作用(P<0.01或P<0.05)。見表2。

表2　SOCS-1對AngⅡ誘導(dǎo)的HMC細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6水平的影響

與對照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與AngⅡ組比較:3)P<0.01，4)P<0.05

3　討　論

HMC細(xì)胞受炎癥等多種因素刺激可異常增殖〔3〕。AngⅡ是血管收縮的活性物質(zhì)，與腎小球系膜細(xì)胞受體結(jié)合，可促進(jìn)IL-6、IL-1β等炎癥因子分泌；炎性浸潤、系膜細(xì)胞異常增值，導(dǎo)致腎臟纖維化及腎小球硬化〔4〕。實(shí)驗(yàn)研究表明，AngⅡ有明顯促進(jìn)大鼠腎小球系膜細(xì)胞顯著增殖的作用〔5〕，因此本實(shí)驗(yàn)選用AngⅡ作為誘導(dǎo)刺激物有理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)研究顯示，DN患者血漿中的IL-6、IL-1β等炎癥因子明顯高于正常人〔6～8〕。故控制HMC增殖、減少炎癥因子分泌是防止、減緩腎小球硬化及纖維化的重要途徑。

1張愛華，黃松明，丁桂霞,等.JNK-c-Jun/AP-1信號通路介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2004;24(1):4-8.

2Nishimoto N,Kishimoto T.Anti-interleukin 6 receptor antibody treatment in rheumatic disease〔J〕.Ann Rheum Dis,2000;59(suppl1):121.

3司徒鎮(zhèn)強(qiáng).細(xì)胞培養(yǎng)〔M〕.北京:世界圖書出版社,2004:246-50.

4Kim S.Molecular and cellular mechanisms of angiotensin Ⅱ mediated cardiovascular and renal disease〔J〕.Pharmacol Rev,2000;52(1):11-34.

5Wolf G,Ziyadeh FN.Molecular mechanisms of diabetic renal hypertrophy〔J〕.Kindey Int,1999;56(2):393-405.

6Kolset SO,Reinholt FP,Jenssen T,etal.Diabetic nephropathy and extracellular matrix〔J〕.J Histochem Cytochem,2012;60(12):976-86.

7Demircan N,Safran BG,Soylu M,etal.Determination of vitreous interleukin-1(IL-1)and tumor necrosis factor(TNF)levels in proliferative diabetic retinopathy〔J〕.Eye(Lond),2006;20(12):1366-9.

8唐愛華，周衛(wèi)惠.腎康寧方對早期糖尿病腎病患者血清TNF-α及IGF-1的影響〔J〕.時珍國醫(yī)國藥,2013;24(11):2606-7.

〔2015-11-19修回〕

(編輯郭菁)

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.003

國家自然科學(xué)基金(81374025)；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷國家重點(diǎn)學(xué)科開放基金

胡志希(1962-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)心腦血管病證本質(zhì)與證治規(guī)律研究。

陳銳(1973-)，女，博士，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事中醫(yī)臨床教學(xué)與科研工作。

R587.2

A

1005-9202(2016)14-3355-02；

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)2長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院

3北京中醫(yī)醫(yī)院順義醫(yī)院