張振東　彭　梅　楊　娟

(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州　貴陽(yáng)　550002)

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土黨參多糖對(duì)半乳糖聯(lián)合三氯化鋁致阿爾茨海默病小鼠腦損傷的影響

張振東1彭梅楊娟

(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550002)

目的研究土黨參多糖(CJP)對(duì)D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁所致小鼠腦神經(jīng)損傷的影響。方法采用皮下注射D-半乳糖聯(lián)合灌胃三氯化鋁造成小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷。以小鼠學(xué)習(xí)記憶成績(jī)、腦組織中的丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、谷胱甘肽(GSH)及乙酰膽堿(Ach)等含量變化為考察指標(biāo)，考察CJP對(duì)腦損傷小鼠的影響。結(jié)果與模型組比較，CJP能改善腦損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶，提高腦中GSH、超氧化物歧化酶(SOD)含量，降低腦中NO和MDA水平。結(jié)論CJP對(duì)D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁所致的小鼠腦損傷有一定的改善作用。

土黨參多糖；D-半乳糖；三氯化鋁；腦損傷

阿爾茨海默病(AD)又叫老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性的神經(jīng)退行性疾病。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，桔?？平疱X豹屬植物土黨參中多糖成分具有促PC12 細(xì)胞分化的神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)樣神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性〔1〕，對(duì)小鼠腦缺血再灌注損傷有保護(hù)作用〔2〕，但土黨參多糖(CJP)是否對(duì)AD小鼠腦損傷有保護(hù)作用還未見(jiàn)報(bào)道。半乳糖和三氯化鋁模型因其在老年斑(SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)及對(duì)膽堿能系統(tǒng)的損害方面均與AD病理改變極為相似，能很大程度上模擬AD〔3〕。本文通過(guò)半乳糖聯(lián)合三氯化鋁制造AD小鼠模型，探討CJP對(duì)AD小鼠腦損傷的影響。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物SPF級(jí)KM小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(20±2)g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2007-001。

1.2藥材與試劑CJP由本課題組提供，多糖含量≥95%；考馬斯亮藍(lán)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)、乙酰膽堿(Ach)等試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3主要儀器小鼠跳臺(tái)記錄儀(參照課題組專利自制)；Morris水迷宮改良自制(仿中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)；RM2235切片機(jī)(德國(guó)Leica 公司)；MD Spectra Max-190連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó)MD公司)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物分組及給藥KM小鼠120只，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后隨機(jī)分為空白組(Blank)、模型組(Model)、CJP高劑量(300 mg/kg，CJP-H)、中劑量(150 mg/kg，CJP-M)、低劑量組(75 mg/kg，CJP-L)，腦復(fù)康對(duì)照組(150 mg/kg，NFK)。藥物用0.5%的CMC-Na配制，按小鼠體重0.2 ml/10 g于造模前3 d開(kāi)始灌胃，空白組接受皮下注射相應(yīng)的無(wú)菌生理鹽水及灌胃生理鹽水；CJP不同劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組灌胃給藥3 d后，模型組及給藥組早上皮下注射D-半乳糖(120 mg/kg)，間隔2 h后灌服生理鹽水或者CJP，下午灌服三氯化鋁(20 mg/kg)造成AD小鼠模型，連續(xù)造模10 w。

1.4.2行為學(xué)檢查

1.4.2.1跳臺(tái)法實(shí)驗(yàn)裝置是10 cm×10 cm×50 cm小鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱，分為5間，箱底是可通36 V電壓連續(xù)刺激的銅柵。右后角置一直徑和高均為4.5 cm的橡皮墊，作為小鼠回避電擊的安全區(qū)。外置高清晰攝像頭監(jiān)控小鼠活動(dòng)情況，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將小鼠置于跳臺(tái)儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后底部銅柵通以36 V、2 mA交流電，記錄動(dòng)物受到電刺激后跳上橡皮墊的反應(yīng)時(shí)間和5 min內(nèi)受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后將小鼠置于跳臺(tái)儀中適應(yīng)3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊的潛伏期和5 min受電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))作為學(xué)習(xí)成績(jī)。

1.4.2.2暗箱法試驗(yàn)時(shí)，先將小鼠背朝洞口放入明室，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)和通電(36 V，2 mA交流電)，小鼠進(jìn)入暗室立即遭到電擊，記錄小鼠受到電擊的時(shí)間，以此作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間和5 min內(nèi)的錯(cuò)誤次數(shù)以此作為記憶成績(jī)。

1.4.2.3Morris型水迷宮〔4〕實(shí)驗(yàn)前1～5 d讓小鼠在Morris水迷宮中定向游泳。將安全臺(tái)固定在標(biāo)有東、南、西、北的任意一個(gè)位置不動(dòng)，每天下午訓(xùn)練，每次隨機(jī)取均分安全臺(tái)對(duì)面半圓的5個(gè)點(diǎn)放入小鼠，記錄小鼠入水時(shí)間和自入水到小鼠自行找到并爬上安全臺(tái)所需時(shí)間作為潛伏期。爬上安全臺(tái)后，讓其在安全臺(tái)上停留5 s。若小鼠120 s后還未找到安全臺(tái)，則人為將小鼠引導(dǎo)上安全臺(tái)停留5 s后，將小鼠從安全臺(tái)上撤離下去休息，連續(xù)訓(xùn)練5 d。第6～7天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，在定向游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即將安全臺(tái)拆離，仍隨機(jī)取5個(gè)入水點(diǎn)中的一個(gè)放入小鼠，計(jì)時(shí)小鼠在原安全臺(tái)所在象限中停留的時(shí)間和經(jīng)過(guò)原象限的次數(shù)，計(jì)算2 d平均值作為成績(jī)。

1.4.3小鼠腦組織中指標(biāo)檢測(cè)小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即處死小鼠并迅速取腦組織，稱重，加入0.9%的冰冷生理鹽水，制備成10%的腦勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定其中的SOD、MDA、NO、GSH、Ach等生化指標(biāo)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。

2　結(jié)　果

2.1CJP對(duì)AD腦損傷小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響與Model組〔(147.11±68.66)s〕比較，藥物組〔CJP-L、CJP-M、CJP-H組分別為(237±105.95)s、(253±103.25)s、(255.65±93.47)s〕記憶潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.01)。藥物組在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)能較好改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙，與NFK組〔(248.02±116.31)s〕比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。Blank組記憶潛伏期為(251.77±122.49)s。小鼠在經(jīng)過(guò)連續(xù)5 d的Morris水迷宮訓(xùn)練后，游泳時(shí)間(學(xué)習(xí)記憶潛伏期)呈現(xiàn)出遞減規(guī)律。Model組小鼠潛伏期變化不大，其他組的潛伏期顯著縮短。見(jiàn)圖1。在第3天，Model組定向航行時(shí)間顯著高于Blank組、藥物組、NFK組，說(shuō)明藥物可提高學(xué)習(xí)記憶能力。第6、7天撤去平，結(jié)果Blank組、藥物組和NFK組小鼠經(jīng)過(guò)原象限的時(shí)間和次數(shù)與Model組相比具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1。

圖1　各組小鼠Morris水迷宮定向航行的逃避潛伏期

組別劑量(mg/kg)時(shí)間(s)次數(shù)Blank組042.73±7.893.22±0.973)Model組026.99±7.111)1.40±0.371)CJP-L組7537.17±10.052)3.30±1.103)CJP-M組15038.18±4.802)3.58±1.673)CJP-H組30039.37±7.032)3.82±1.393)NFK10041.30±17.013)3.60±2.113)

與Blank組比較：1)P<0.01；與Model組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

2.2CJP對(duì)AD小鼠腦組織中相關(guān)指標(biāo)的影響與Blank組比較，Model組小鼠大腦組織中MDA、NO增高，而GSH、SOD含量降低，但除了SOD含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)以外，其他指標(biāo)差異不顯著。與Model組相比，CJP 3個(gè)劑量組MDA、NO含量降低，GSH、SOD含量增加，其中CJP-M、-H組MDA和SOD含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。造模70 d后，CJP-H組小鼠腦組織Ach含量接近正常值，CJP-L組尚未回升至正常水平(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　CJP對(duì)小鼠大腦組織生化指標(biāo)的影響

與Blank組比較：1)P<0.05；與Model組比較：2)P<0.05

3　討　論

有學(xué)者報(bào)道D-半乳糖和三氯化鋁制作的多重復(fù)制AD小鼠模型能導(dǎo)致小鼠記憶減退、皮質(zhì)和海馬產(chǎn)生老年斑等AD樣癥狀〔5〕，成本低廉。AD一般發(fā)生在老年人群中，年齡增長(zhǎng)是發(fā)病的一大危險(xiǎn)因素，可通過(guò)對(duì)成年小鼠注射半乳糖，造成亞急性衰老模型模擬AD發(fā)病特點(diǎn)〔6〕。三氯化鋁超過(guò)正常攝入量可導(dǎo)致動(dòng)物行為異常，如食欲下降、反應(yīng)遲鈍、行動(dòng)遲緩、學(xué)習(xí)記憶能力下降；同時(shí)，破壞膽堿能神經(jīng)功能，還可增強(qiáng)β-分泌酶和γ-分泌酶活性，增加淀粉樣蛋白的產(chǎn)量。鋁攝入過(guò)量而積聚可使反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使其以不溶性形式沉積于腦組織，形成老年斑〔7,8〕。

關(guān)于AD 的發(fā)病機(jī)制，目前比較認(rèn)可的假說(shuō)為氧化應(yīng)激假說(shuō)、自由基損傷假說(shuō)、能量代謝假說(shuō)、淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)以及膽堿能假說(shuō)等〔9〕。AD患者體內(nèi)SOD 和MDA 水平變化情況，可作為臨床上診斷AD的主要方法〔10〕。Ach是腦內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，膽堿能系統(tǒng)對(duì)機(jī)體維持正常的認(rèn)知功能發(fā)揮重要作用。Ach在皮質(zhì)和海馬的缺失將導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知功能顯著降低〔11〕。研究發(fā)現(xiàn)，增加認(rèn)知障礙患者海馬Ach 濃度后，認(rèn)知和空間記憶功能均得到改善〔12〕。本研究顯示，CJP對(duì)SOD、MDA、Ach的影響比較明顯。

1楊小生,張占軍,楊再昌,等.土黨參多糖、衍生物及其制備方法和應(yīng)用:中國(guó)200510200024.2〔P〕.2007-09-12

2張振東,楊娟,吳蘭芳,等.土黨參多糖對(duì)小鼠腦缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2011;27(4):508-11.

3Scali C,Prosperi C,Vannucchi MG,etal.Brain inflammatory reaction in an animal model of neuronal degeneration and its modulation by an anti-inflammatory drug:Implication in Alzheimer's disease〔J〕.Eur J Neurosci,2000;12(6):1900-12.

4黃忠仕,焦楊,張士軍,等.龍眼參多糖對(duì)老年癡呆模型SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶的改善作用〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2008;28(21):2086-8.

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7Rao KSJ，Anitha S，Latha KS.Aluminium-induced neurodegeneration in the hippocampus of aged rabbits mimics Alzheimer's disease〔J〕.Alzheimer Rep，2000;3(2):83-8.

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〔2015-11-20修回〕

(編輯郭菁)

The effect of Campanumoea javanica polysaccharide on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride

ZHANG Zheng-Dong,PENG Mei,YANG Juan.

Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,Guizhou,China

ObjectiveTo study the effect of Campanumoea javanica polysaccharide(CJP)on brain injury of Alzheimer's mice induced by D-galactose and aluminium chloride.MethodsThe nervous system of mice were damaged by subcutaneous injection of D-galactose and intragastric administration of AlCl3.The effects of CJP on brain damage in mice were studied,including the observation of learning and memory performance,the contents of malondialdehyde(MDA),nitric oxide(NO),glutathione(GSH)and acetylcholine(Ach).ResultsCompared with model group,CJP improved the learning and memory abilities,increase the contents of GSH and SOD in brain,while decrease the contents of NO and MDA.ConclusionsCJP has certain effect on brain injury induced by D-galactose combined with aluminum chloride.

Campanumoea javanica polysaccharide;D-galactose;Aluminium chloride;Brain injury

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.002

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(No.81160513)

楊娟(1971-)，女，研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物研究。

張振東(1982-)，男，中級(jí)工程師，碩士，主要從事食品質(zhì)量與安全研究。

R741

A

1005-9202(2016)14-3353-03；

1阜陽(yáng)市食品藥品監(jiān)督管理局