姜國華　費洪新　周忠光

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江　哈爾濱　150040)

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·基礎研究·

電針對阿爾茨海默病小鼠海馬晚期糖基化終末產物受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白1的影響及機制

姜國華費洪新1周忠光

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱150040)

目的探討電針(EA)對阿爾茨海默病(AD)小鼠海馬晚期糖基化終末產物受體(RAGE)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)1的影響及機制。方法復制AD小鼠模型，小鼠隨機分為對照組，模型組，治療組(多奈哌齊0.001 g/kg)，EA(針刺腎俞、百會、大椎)，8只/組。采用小鼠雙側海馬微量注射(10 μg)β-淀粉樣蛋白1～42(Aβ1～42，2 g/L)誘導AD小鼠，1次/d，持續(xù)30 d。采用Morris水迷宮測試小鼠學習記憶能力，電鏡觀察海馬結構，檢測小鼠臟器指數(shù)。采用雙抗體夾心法測定海馬APP、Aβ1～40和血清Aβ1～40，海馬組織RAGE和LRP1。采用RT-PCR檢測海馬RAGE和LRP1 mRNA表達。結果與模型組比較，EA組小鼠海馬學習記憶能力明顯改善(P<0.05)，海馬神經(jīng)元結構明顯改善，脾和胸腺臟器指數(shù)明顯增加(P<0.05)，海馬APP、Aβ1～40和RAGE水平明顯降低(P<0.05)，血清Aβ1～40和海馬LRP1明顯增加(P<0.05)。結論EA通過下調海馬RAGE和上調海馬LRP1表達改善AD小鼠學習記憶能力、海馬電鏡結構、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)和海馬Aβ1～40水平。

電針；阿爾茨海默?。坏兔芏戎鞍资荏w相關蛋白1；晚期糖基化終末產物受體

阿爾茨海默病(AD)是一種β-淀粉樣蛋白(Aβ)積累引起的老年人常見疾病〔1，2〕。Aβ主要分為Aβ1～42和Aβ1～40，腦Aβ1～40可跨越血腦屏障(BBB)進行清除〔3〕，BBB基本結構中腦微血管內皮細胞(BMEC)參與了Aβ清除〔4,5〕。BMEC上存在晚期糖基化終末產物受體(RAGE)，RAGE與Aβ結合可介導神經(jīng)毒性〔6〕；RAGE參與Aβ運輸并引起Aβ在腦內積聚〔7〕，使用RAGE抑制劑可改善AD腦功能〔8〕。BBB上低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)1也可介導Aβ轉運〔9〕，而AD患者LRP1表達下調〔10〕。電針(EA)可調節(jié)AD海馬長時程增強電位〔11〕，治療抑郁癥〔12〕，減少麻醉劑使用量〔13〕，調節(jié)機體血壓〔14〕等，但是EA對AD小鼠海馬RAGE和LRP1的影響和機制，國內外未見報道?；诖?，本研究探討EA對AD小鼠海馬RAGE和LRP1的影響及機制。

1　材料和方法

1.1實驗動物清潔級雄性8周齡C57BL/6小鼠，體重(23±2)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。動物常規(guī)飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2主要藥物及其儀器藥物多奈哌齊(重慶植恩藥業(yè)有限公司，批號20141201)；APP、Aβ1～40、RAGE和LRP1酶聯(lián)免疫試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20140401)；Aβ1～42(Sigma公司)；其他試劑均為國產分析純。儀器：6100型RT-雷杜酶標儀(美國RT公司)；TCNAI-G2型透射電鏡(荷蘭公司)；STW-1型腦立體定位儀(成都儀器廠)；Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設備有限公司)；Applied Biosystems step one plus定量PCR儀(美國應用生物系統(tǒng)公司)；PLZOZ-S型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)等。

1.3方法

1.3.1AD模型復制參考文獻〔15〕制備AD小鼠模型。小鼠麻醉后，固定小鼠頭部和四肢，剪去頭頂部毛發(fā)，定位小鼠海馬區(qū)，用微量加樣器于雙側腦室海馬區(qū)連續(xù)注入10 μg的Aβ1～42(2 g/L)，針頭置留10 min后包扎小鼠。對照組小鼠雙側腦室注射等量生理鹽水。

1.3.2分組和給藥C57BL/6小鼠隨機分為對照組、模型組、治療組和EA組，每組8只。對照組和模型組灌胃給予生理鹽水，治療組灌胃給予多奈哌齊0.001 g/kg，EA組使用0.25 mm×0.25 mm無菌針針刺腎俞、百會和大椎穴位，雙側腎俞直刺4 mm，百會平刺2.5 mm，大椎直刺3 mm，腎俞、百會和大椎連接電針治療儀器(30 Hz，2 V)，1次/d，連續(xù)治療30 d。

1.3.3測定逃避潛伏期采用Morris水迷宮檢測逃避潛伏期，評價小鼠的學習能力。水池內放置清潔自來水及奶粉，水深20 cm，水溫(23±2)℃，平臺放于第Ⅳ象限，訓練時間為4 d，1次/d，60 s/次。第5天測試，觀察小鼠到達平臺位置的逃避潛伏期。

1.3.4測定游泳距離過程同1.3.3，在Morris水迷宮測試第5天時撤去第Ⅳ象限的移動平臺，測定小鼠在60 s內的游泳距離，評價小鼠的記憶能力。

1.3.5測定目標象限停留時間和跨平臺次數(shù)過程同1.3.3，測試第5天的時候撤去平臺，測定小鼠在60 s內在第Ⅳ象限的游泳時間(目標象限停留時間)和跨越平臺的次數(shù)(跨平臺次數(shù))，綜合評價小鼠學習記憶保持能力。

1.3.6觀察海馬CA1區(qū)電鏡結構Morris水迷宮測試結束后，小鼠左心室灌注70 ml生理鹽水，沖刷小鼠的循環(huán)系統(tǒng)，2.5%戊二醛灌注70 ml，取小鼠海馬CA1區(qū)后2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、脫水、包埋、切片等，透射電鏡觀察小鼠海馬CA1區(qū)的電鏡結構。

1.3.7測定臟器指數(shù)Morris水迷宮測試結束后，電子天平稱取小鼠的體重。迅速斷頭處死小鼠，取材小鼠脾和胸腺，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質量(mg)/體重(g)。

1.3.8測定海馬RAGE、LRP1和其他因子Morris水迷宮測試結束后，摘除眼球后取血，取小鼠海馬，勻漿，靜置海馬勻漿液和血液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝，-80℃冰箱內保存。在酶標儀上450 nm波長處測定吸光度(A)，繪制標準曲線，計算小鼠海馬RAGE、LRP1、淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)、Aβ1～40和血清Aβ1～40水平。

1.3.9測定海馬RAGE 和LRP1 mRNA表達實驗結束后，取材海馬，按照試劑盒說明書，應用Trizol試劑盒提取海馬總RNA，合成cDNA，PCR擴增。RAGE引物(上游：5′-AAA ACG ACA ACC CAG GCG T-3′，下游：5′-ATT CTC TGG CAT CTC CGC TTC-3′)、LRP1引物(上游：5′-CCG ACT GGC GAA CAA ATA CAC-3′，下游：5′-ATC GGC TTT GTT GCA CGT G-3′)、β-actin引物(上游：5′-CGT GCG TGA CAT CAA AGA GAA-3′，下游：5′-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3′)均由中國上海捷瑞生物工程有限公司合成，PCR參數(shù)為50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)，RAGE 和LRP1 mRNA結果以2-ΔΔCt法表示。

1.4統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)行單因素方差分析。

2　結　果

2.1EA對AD小鼠逃避潛伏期的影響各組逃避潛伏期隨著訓練次數(shù)的增加，而呈現(xiàn)整體縮短的趨勢。與對照組比較，模型組小鼠逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。見表1。

2.2EA對AD小鼠游泳距離的影響各組游泳距離隨著訓練次數(shù)的增加，而呈現(xiàn)整體下降的趨勢。與對照組比較，模型組小鼠游泳距離明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠游泳距離明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1　EA對AD小鼠逃避潛伏期的影響

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2　EA對AD小鼠游泳距離的影響

2.3EA對AD小鼠目標象限停留時間和跨平臺次數(shù)的影響與對照組比較，模型組小鼠目標象限停留時間明顯縮短且跨平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠目標象限停留時間明顯延長且跨平臺次數(shù)明顯增加(P<0.05)。見表3。

表3　EA對AD小鼠目標象限停留時間和跨平臺次數(shù)的影響

2.4EA對AD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元電鏡結構的影響對照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞核大而圓，核仁清晰；模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元不規(guī)則，神經(jīng)元較小且萎縮；經(jīng)過治療后，治療組和EA組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元較大，結構比較清晰。見圖1。

圖1　小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元電鏡結構(透射電鏡，×2 550)

2.5EA對AD小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞質電鏡結構的影響對照組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞質粗面內質網(wǎng)較多，線粒體清晰；模型組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞器較少；經(jīng)過治療后，治療組和EA組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞器較多，核膜清晰。見圖2。

圖2　小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞質電鏡結構(透射電鏡，×16 500)

2.6EA對AD小鼠臟器指數(shù)的影響與對照組比較，模型組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4　EA對AD小鼠臟器指數(shù)的影響

2.7EA對AD小鼠海馬APP、Aβ1～40和血清Aβ1～40的影響與對照組比較，模型組小鼠海馬APP和Aβ1～40明顯增加，血清Aβ1～40明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠海馬APP和Aβ1～40明顯降低，而血清Aβ1～40明顯增加(P<0.05)。見表5。

2.8EA對AD小鼠海馬RAGE和LRP1的影響表6可見，與對照組比較，模型組小鼠海馬RAGE明顯增加，海馬LRP1明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組和EA組小鼠海馬RAGE明顯降低，海馬LRP1明顯增加(P<0.05)。

表5　EA對AD小鼠海馬APP、Aβ1～40和血清Aβ1～40的影響

表6　EA對AD小鼠海馬RAGE和LRP1的影響

2.9EA對AD小鼠海馬RAGE mRNA表達的影響與對照組(1.030 2±0.254 8)比較，模型組小鼠海馬RAGE mRNA(1.488 7±0.208 3)明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，治療組(1.113 1±0.342 8)和EA組(1.071 5±0.373 3)小鼠海馬RAGE mRNA明顯降低(P<0.05)。

2.10EA對AD小鼠海馬LRP1 mRNA表達的影響與對照組(1.030 0±0.265 2)比較，模型組小鼠海馬LRP1 mRNA(0.658 8±0.128 6)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，治療組(0.934 7±0.151 0)和EA組(0.902 3±0.227 1)小鼠海馬LRP1 mRNA明顯增加(P<0.05)。

3　討　論

Morris水迷宮實驗結果顯示，模型小鼠逃避潛伏期延長和游泳距離增加，同時目標象限停留時間和跨平臺次數(shù)減少，說明模型建立成功；經(jīng)過EA治療后，模型小鼠對移動平臺的記憶能力增強，說明EA可改善AD小鼠的學習記憶能力。

研究顯示，海馬CA1區(qū)與學習記憶有一定關聯(lián)〔16，17〕。本實驗中模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細胞器較少，提示模型組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結構異常，適合開展實驗研究。經(jīng)過EA治療后，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的結構得到恢復，說明EA可改善海馬CA1區(qū)的形態(tài)結構。

本實驗模型組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)降低，提示免疫器官相對質量減輕，產生B細胞和T細胞的數(shù)量減少，說明模型組小鼠體液免疫和細胞免疫水平較低。經(jīng)過EA治療后，免疫器官的相對質量增加，說明EA可增強AD小鼠免疫功能。

本實驗檢測了海馬APP、Aβ1～40和血清Aβ1～40水平。結果顯示，海馬APP和Aβ1～40增加，而血清Aβ1～40降低，說明腦Aβ增加加重AD。經(jīng)過EA治療后，EA組海馬APP和Aβ1～40降低，而血清Aβ1～40增加，提示腦海馬經(jīng)過某種特殊機制將Aβ1～40外排到血清或減少血清Aβ1～40進入腦組織。

RAGE促進Aβ進入腦，LRP1促進Aβ轉運出腦。本文結果表明，RAGE與Aβ1～40結合增加，促進Aβ1～40進入腦；同時，由于海馬LRP1水平降低，減少了Aβ1～40外排出腦，加速了Aβ的沉積。經(jīng)過EA治療后，EA組小鼠海馬RAGE水平降低，提示RAGE與Aβ1～40結合減少，減少了Aβ1～40進入腦；同時，海馬LRP1水平增加，加速了Aβ1～40外排出腦，從而減緩AD的發(fā)生發(fā)展。本實驗顯示海馬RAGE和LRP1的變化趨勢與海馬及血清Aβ1～40密切相關。

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〔2015-11-06修回〕

(編輯郭菁)

Effects and related mechanisms of electro acupuncture on RAGE and LRP1 of hippocampus in Alzheimer′s disease mice

JIANG Guo-Hua，F(xiàn)EI Hong-Xin，ZHOU Zhong-Guang.

Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,Heilongjiang，China

ObjectiveTo explore the effects and related mechanisms of electro acupuncture(EA)on RAGE and LRP1 of hippocampus in Alzheimer′s disease(AD)mice.MethodsAD model mice were duplicated and randomly divided into control，model，treatment(Donepezil 0.001 g/kg)and electro acupuncture groups(bilateralm Shenshu，Baihui and Dazhui)，8 mice in each group.AD model mice were made by using microinjection of 10 μg incubated amyloid beta1～42(Aβ1～422 g/L)into the dorsal blade of the dentale gyrus in the bilateral hippocampus.Treatment was done once each day for 30 days.The Morris water maze was used to observe the learning and memory ability.After the treatment all animals were sacrificed，electron microscopy of hippocampus was observed.After the treatment all animals organ coefficients of AD mice were measured.Biochemical methods were used to determine the content of APP and Aβ1～40in the hippocampus and Aβ1～40in the serum，the content of RAGE and LRP1 in the hippocampus.RT-PCR method was used to determine the expression of RAGE and LRP1 mRNA in the hippocampus.ResultsCompared with the model group，EA could significantly improve the learning and memory ability of AD mice(P<0.05).EA recovered brain maintain normal morphological structure of hippocampus tissue，the organ coefficients of splenic and thymus significantly increased(P<0.05)，APP,Aβ1～40and RAGE in the hippocampus tissue were significantly decreased(P<0.05)，Aβ1～40in the serum and LRP1 in the hippocampus tissue were significantly increased(P<0.05).ConclusionsEA could significantly improve the learning and memory ability and Aβ1～40in hippocampus and improve normal morphological structure of the hippocampus and the organ coefficients of splenic and thymus in AD mice.EA plays a certain role in the treatment of AD by inhibiting RAGE and increasing LRP1.

Electro acupuncture；Alzheimer′s disease；LRP1;RAGE

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.14.001

國家自然科學基金(81173576，81373777)；黑龍江省自然基金(H201354)；國家高校博士學科點科研基金(博導類，20132327110010)

周忠光(1957-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事癡呆、痛風、腫瘤研究。

姜國華(1966-)，男，博士，教授，碩士生導師，主要從事癡呆、腫瘤、痛風研究。

R285

A

1005-9202(2016)14-3349-03；

1齊齊哈爾醫(yī)學院