陳紹博，曾巧英（.甘肅省獸醫(yī)局，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030）

豬瘟病毒E0基因檢測方法的建立及甘肅河西地區(qū)E0基因特征分析

陳紹博1，曾巧英2*
（1.甘肅省獸醫(yī)局，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730030）

為給甘肅地區(qū)豬瘟的防控和檢測提供參考資料，本研究根據典型豬瘟病毒的E0基因設計引物，建立豬瘟RT-PCR檢測方法，并評估其特異性，同時用該方法檢測甘肅河西地區(qū)豬瘟的流行狀況，通過基因測序分析E0基因序列特征。建立的豬瘟RT-PCR檢測方法對豬瘟病毒cDNA檢測為陽性，而對其他病毒cDNA檢測為陰性，甘肅省河西地區(qū)豬瘟流行廣泛存在，流行率為26.92%，且流行毒株核苷酸同源性為80.2%～96.3%；氨基酸同源性為73.0%～95.4%。結果表明本研究建立的豬瘟RT-PCR檢測方法特異性強，且甘肅河西地區(qū)豬瘟的流行毒株E0基因進化高度保守。

豬瘟；RT-PCR；E0；甘肅

豬瘟（Classical swine fever，CSF） 是豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的急性病毒學傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率［1-3］。世界各國均有CSF分布，其中養(yǎng)豬較多的國家感染更為嚴重，可造成嚴重的農業(yè)經濟損失［2］。CSFV為含有一個正向單鏈RNA且被囊膜包裹的病毒粒子，分類學上屬于黃病毒科、瘟病毒屬重要成員。CSFV基因組長度約為12.3 kb，但在長期流行過程中，CSFV的穩(wěn)定性較高，僅有較少的核苷酸發(fā)生改變［4，5］，其中E0基因作為一種具有多功能的結構蛋白，可編碼糖膜，誘導機體產生中合體［6］，長期進化過程中E0一直保持RNase活性，介導宿主淋巴細胞的凋亡而使宿主產生免疫抑制導致持續(xù)感染［6］，這些機制表明CSFV感染致病過程中E0基因發(fā)揮著重要作用。RT-RCR作為現代診斷技術之一，在CSFV診斷技術中敏感性最強，而E0基因進化過程中高度保守，是CSFV分子診斷方法建立的重要靶基因，但CSFV流行過程中，隨著感染時間的推移病毒基因的變異不能忽視。因此本研究試圖通過E0基因優(yōu)化CSFV的 RT-PCR檢測方法，建立更加穩(wěn)定、準確的CSFV檢測方法，同時利用該方法分析甘肅河西地區(qū)CSFV的流行狀況及E0基因序列特征，為CSF防控提供可靠數據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病毒豬瘟病毒參考株為疫苗毒株，參照毒株豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、牛病毒性腹瀉黏膜病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）等毒株都由甘肅省動物疫病預防控制中心提供。

1.1.2病料疑似豬瘟病毒感染組織病料由甘肅省動物疫病預防控制中心采集、共計52份，其中武威10份、張掖14份、酒泉11份、嘉峪關8份，金昌9，病料組織主要為動物肝臟，置于-70℃保存。

1.1.3主要試劑動物組織總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、PCR mix、PCR產物膠回收試劑盒均為OMEGA公司；PMD-18T載體、T4DNA ligase、DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞均購自TaKaRas生物公司。

1.1.4引物設計與合成根據 Genbank中已公布的CSFV全基因組序列采用Mega6.0軟件分析其保守性，通過Primer5.0軟件設計可以擴增CSFV E0基因序列的上下游引物E0-F：TACCAACCAGTTGAAGCCGA和E0-R TCTTTCCGTCTTCCGCGTTA，與其擴增片段為835bp，由華大基因（北京）公司合成，用DEPC水將其稀釋終濃度為25 μmol/L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法

1.2.1病毒RNA的提取及反轉錄 參照總RNA提取試劑盒說明書分別從病毒毒株或病料中提取總RNA，溶解于20μL的ddH2O中，參照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，-20℃保存。

1.2.2E0基因的PCR檢測用設計的引物檢測不同病毒，PCR反應體系為2×PCR Mix10 μl、上下游引物各0.5 μl、cDNA模板1 μl、ddH2O 8 μl，總反應體積20 μl。PCR反應程序為：95℃5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃1 min，反應35個循環(huán)；最后延伸72℃10 min，反應結束后取PCR產物進行凝膠電泳，凝膠濃度為12 mg/ml，120V電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)呈像觀察。

1.2.3病料中E0基因的PCR檢測用以上建立的E0基因PCR檢測方法對收集的52份病料進行檢測，每個地區(qū)隨機選取1株E0基因為陽性的PCR產物，用膠回收試劑盒回收PCR擴增的條帶，將回收DNA用PMD-18T載體和T4DNA ligase進行連接，轉入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，經Amp+平板篩選，選取單個菌落進行培養(yǎng)，并對菌液進行PCR檢測，陽性菌液送華大基因生物公司進行測序。同時分析不同地區(qū)病料中E0基因的陽性比率。

1.2.4 E0基因和氨基酸的序列比對分析用DNAstar 和Mega 6.0軟件，將本研究獲得陽性豬瘟病毒E0基因與Genbank發(fā)表的國內外典型豬瘟代表株進行核苷酸和氨基酸同源性比較，構建進化樹。

2　結果

2.1 E0基因的PCR檢測結果

以不同的病毒cDNA和超純水為模板，PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳表明，只有以豬瘟病毒為模板的PCR反應可檢測出835 bp的目的條帶，與預期大小一致（圖1），其他3種毒株和超純水為模板的反應中未見擴增條帶（圖1），表明所建立的E0基因的PCR檢測方法具有較強的特異性。

2.2不同地區(qū)疑似病料CSFV檢測

用建立的E0基因PCR檢測方法檢測甘肅省河西地區(qū)武威（10份）、張掖（14份）、酒泉（11份）、嘉峪關（8份）、金昌（9份）5市疑似CSF的動物肝臟組織，PCR擴增產物經凝膠電泳顯示共有14份病料為陽性，陽性率為26.92%（14/52）；其中武威2份（圖2D）、張掖4份（圖2E）、酒泉3份（圖2C）、嘉峪關2份（圖2A）、金昌3份（圖2B）、，陽性率分別為20.00% （2/10）；28.57%（4/14）、27.27%（3/11）、33.33%（3/9）和25.00%（2/4）。

圖1 CSFV E0基因RT-PCR檢測方法的特異性M：DNA maker（2000bp）；1-5分別為CSFV，PPV，BVDV，PCV和水的RT-PCR檢測結果.

圖2　甘肅河西不同地區(qū)疑似病料RT-PCR檢測結果A：嘉峪關；B：金昌；C：酒泉；D：武威；E：張掖

2.3不同地區(qū)CSFV E0基因測序

隨機選取一份甘肅省河西地區(qū)5市E0基因為陽性的病料PCR產物，膠回收產物用PMD-18T載體和T4DNAligase進行連接轉化感受態(tài)細胞后菌液進行E0基因PCR檢測，發(fā)現5份菌液均可檢測到835 bp的擴增條帶（圖3），測序后獲得5株CSFV流行毒株的E0基因序列，分別命名為GSWW01-E0、GSZY01-E0、GSJQ01-E0、GSJYG01-E0和GSJC01-E0。

圖3　部分CSEV陽性菌業(yè)RT-PCR檢測鑒定M：DNA maker（2000bp）；1-5分別為嘉峪關、酒泉、金昌、武威和張掖部分CSFV毒株RT-PCR檢測結果

2.4核苷酸和氨基酸同源性分析

將本研究中得到的5株甘肅CSFV毒株E0基因序列與Genbank中的典型毒株HCLV（No.AF091507.01）、YI9908（No.KT716271.1）、CSFV-GZ-2009（HQ380231. 1）、Riems（AY259122.1）的E0基因核苷酸和氨基酸序列同源性比對如圖4所示：基因序列分析可知與HCLV、HuN23/2013、CSFV-GZ-2009、Riems的序列同源性分別為：80.2%～96.3%；轉化后的氨基酸同源性分別為：73.0%～95.4%；表明研究的甘肅5株CSFV毒株E0基因發(fā)生了一定的變異，但差異不大，其5株間的E0基因也存在一定變異。

從系統(tǒng)進化樹中可以看出甘肅流行毒株均分布于獨立的亞枝，在遺傳關系上與CSFV-GZ-2009親緣性接近，而YI9908的進化關系較遠。

2.5 E0蛋白Rnase活性區(qū)域氨基酸分析

E0蛋白中兩個具有Rnase活性的氨基酸序列別為：SLHGIWPE和EWNKHGWC，在甘肅5株E0蛋白的氨基酸序列分別位于28-35位和75-82位（圖6）。分析發(fā)現甘肅5株CSFV毒株E0蛋白的SLHGIWPE基因相同，參考毒株HCLV和Riems的第35個氨基酸發(fā)生改變，E變?yōu)镚。而EWNKHGWC氨基酸中GSJC01-E0的第75個氨基酸發(fā)生改變，E變?yōu)镵，其他毒株氨基酸序列沒有變化。

圖4　不同CSFV毒株EO核苷酸、氨基酸同源性比對A：核苷酸同源性；B：氨基酸同源性

圖5　甘肅河西地區(qū)CSFV流行毒株與參考毒株EO基因系統(tǒng)進化樹

圖6　CSFVEO蛋白兩個Rnase活性區(qū)域的氨基酸序列比較

3　討論

CSFV作為危害養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一、建立其快速的檢測方法對于該病的防控具有重要意義。目前農業(yè)部門關于CSFV的檢測方法較多，比如酶聯(lián)免疫

［1］Edwards S，Fukusho A，Lefevre P-C，et al.Classical swine fever：the global situation［J］.Veterinary microbiology，吸附實驗、免疫膠體金技術和RT-RCR技術［7］。目前RT-RCR技術已經作為病毒感染分子檢測方法之一，其具有快速、敏感、特異性強等優(yōu)點［8］。因此在我國不同省份常用該技術檢測CSFV的流行狀況［3，6］，但不同的學者針對CSFV檢測方法的建立采取了不同的靶基因，如E2、NS5B和3’-UTR基因等。本研究基于E0基因在進化中高度保守，通過分析CSFV典型毒株E0基因的序列特征，建立CSFV RT-PCR檢測方法，實驗結果表明本研究建立的方法特異性強，可用于豬瘟的檢測、對豬細小病毒等反應均為陰性。

應用建立的CSFV RT-PCR檢測方法分析甘肅省河西地區(qū)疑似病豬中CSFV的流行狀況結果顯示52份病料中14份病料為陽性，陽性率為26.92%，且張掖、嘉峪關、酒泉、武威、金昌均處在陽性病料，表明CSFV在河西地區(qū)廣泛存在，最高感染率為33.33%，最低為20.00%，可見在甘肅豬瘟也作為豬場防控的重要疫病不能被忽視，這樣結果與其他省份豬瘟的流行狀況相似［9，10］。同時通過隨機挑選進行基因測序表明本研究建立的豬瘟CSFV的檢測方法的可用于甘肅地區(qū)豬瘟感染的流行病學分析。

近年，由于長期免疫CSFV使CSFV基因在一定程度上發(fā)生突變，從而造成免疫失?。?，11］，而在CSFVE0蛋白中存在兩個具有Rnase活性的氨基酸序列，這與病毒可以持續(xù)感染機體存在一定的關系，而且在病毒復制過程中發(fā)揮作用［12］，因此研究CSFVE0蛋白的分子特征具有重要意義。本研究通過分析5株CSFV E0蛋白的基因和氨基酸序列，其與典型毒株的核苷酸同源性為80.2%～96.3%，氨基酸同源性為73.0%～95.4%，可見同源性較高，可能為相似毒株感染所致，但5株之間的核苷酸和氨基酸也存在一定的差異，這種差異是否會導致致病差異有待研究。分析發(fā)現甘肅5株CSFV毒株E0蛋白的SLHGIWPE基因相同，參考毒株HCLV和Riems的第35個氨基酸發(fā)生改變，E變?yōu)镚。而EWNKHGWC氨基酸中GSJC01-E0的第75個氨基酸發(fā)生改變，E變?yōu)镵，其他毒株氨基酸序列沒有變化，這種差異是否會導致毒性差異也需確認。

總之，本研究根據豬瘟病毒基因組中高度保守的E0蛋白核苷酸序列，建立了RT-PCR快速檢測方法，檢測結果特異性較高，該方法檢測甘肅省河西地區(qū)CSFV感染結果表明該地區(qū)廣泛存在CSFV感染，感染率為26.92%，且該地區(qū)流行CSFV的E0基因同源性較高，可能為相似病毒感染。

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（編輯：高真貞）

S852.65+1

A

1006-799X（2016）11-0065-03

國家自然科學基金項目（31260616），甘肅農業(yè)大學伏羲杰出人才項目。

陳紹博（1984-），男，甘肅景泰人，碩士研究生，研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學。

曾巧英（1968-），女，博士，教授，研究方向為動物疫病的分子致病機理及免疫防制。