時少坤，馮衛(wèi)權(quán)，鄧國華，彭景書（廣東省深圳市漁業(yè)服務(wù)與水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣東 深圳 518067）

黑莓鱸一種致病菌的發(fā)現(xiàn)及分離鑒定

時少坤，馮衛(wèi)權(quán)，鄧國華，彭景書
（廣東省深圳市漁業(yè)服務(wù)與水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，廣東 深圳 518067）

從瀕死的黑莓鱸（Pomoxisnigromac ufastus）病灶內(nèi)，分離純化一株優(yōu)勢菌B017，用生理生化、細菌/藥敏分析儀、16S rRNA基因序列分析等方法對其進行鑒定，采用回歸感染的方法對其致病性檢驗；同時進行藥敏感性試驗。結(jié)果表明，該致病菌為類志賀鄰單胞菌（Plesiomonas shigeloide）；AHM試驗、運動力試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗均為陽性，革蘭氏陰性菌，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷等5種糖類。該菌對頭孢曲松、頭孢噻吩、頭孢唑林等頭孢類藥物敏感，對卡那霉素、萬古霉素和哌拉西林等耐藥，對黑莓鱸的半致死量為2.6×104cfu/g。

黑莓鱸；類志賀鄰單胞菌；分離；鑒定

黑莓鱸，也稱美國銀斑、銀斑魚，屬日鱸科，莓鱸屬，是一種中小型廣溫性魚類，廣泛分布在北美大陸的江河湖泊中，于1993年由珠江水產(chǎn)研究所從美國引進。黑莓鱸適應(yīng)能力強，其生存水溫1～38 ℃，最適生長水溫15～30 ℃，為偏肉食的雜食性魚類，抗病能力強，易于飼養(yǎng)，肉質(zhì)緊密，味道鮮美，近年來在珠三角和國內(nèi)其他地區(qū)均有養(yǎng)殖。2014年8月，深圳某養(yǎng)殖場的黑莓鱸發(fā)生發(fā)病死亡，發(fā)病率約為50%，死亡率為30%～40%，病魚的主要癥狀表現(xiàn)為魚眼球突出，鰓絲發(fā)白，體表出血；肝臟、腎臟有出血點；膽囊、脾臟腫大；腸道有烏黑色內(nèi)容物，肛門紅腫。自患病魚體內(nèi)分離純化得到優(yōu)勢菌株B017，經(jīng)鑒定為類志賀鄰單胞菌。

類志賀鄰單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，廣泛分布于自然界，尤其是水體及動物體內(nèi)，是一種世界性分布的細菌［1-4］。有報道顯示，類志賀鄰單胞菌可引起中華鱉（Trionys sinensis）、暗紋東方鲀（Takifagu obsurus）、鱘（Huso dauricus）、草魚（Ctenopharyngodon idellus）等水生動物發(fā)病死亡［1-6］。但類志賀鄰單胞菌能引起黑莓鱸發(fā)病死亡，還未曾有報道。通過回歸感染等實驗，證明其為引起黑莓鱸發(fā)病的致病菌；通過藥敏試驗，發(fā)現(xiàn)了幾種該菌敏感的藥物。通過本實驗，為黑莓鱸的健康養(yǎng)殖和病害防治提供了一定的理論基礎(chǔ)，對黑莓鱸的順利推廣具有重要意義。

1　樣品及樣品處理

病樣采自深圳市某黑莓鱸養(yǎng)殖場，具有明顯的臨床癥狀。健康黑莓鱸購于廣州市某養(yǎng)殖場，規(guī)格為7.9±1.1 cm，約400尾，暫養(yǎng)于實驗室水族箱中供人工感染試驗。暫養(yǎng)期間，每天早晚投喂一次，以30 min內(nèi)吃完為宜并清污，及時剔除死亡和淘汰活力弱個體，暫養(yǎng)時間為10 d。人工感染試驗前48 h停止投食。

2　實驗方法

2.1 病原的分離和純化

選取具有典型癥狀的瀕死黑莓鱸，用滅菌生理鹽水清洗體表。無菌條件下，分別取其肝、脾、腎和出血點處肌肉，于1.5 mL離心管中，剪碎混勻。取約0.5 g樣品放在另一個離心管中，然后加入0.5 mL的生理鹽水，用滅菌的研磨棒充分研磨，取200 μL組織懸液，分別涂布于腦心浸出液瓊脂培養(yǎng)基和血瓊脂平板上，28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌落，于普通培養(yǎng)基（NA）上經(jīng)2次純化培養(yǎng)后，得到菌株B017。

2.2 菌落保存

將B017劃線于NA斜面上，28 ℃培養(yǎng)24 h后，用移液器加入1 mL的淡水保種液，振蕩器充分振蕩后，將菌液移取至保種管中，-80 ℃保存，備用。

2.3 形態(tài)觀察

取NA平板上第二次純化的菌株，經(jīng)革蘭氏染色后，油鏡鏡檢。

2.4 感染試驗

2.4.1 回歸感染試驗

回歸感染試驗分3個實驗組和1個對照組。將活化后的B017，接種于腦心浸出液，28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h后，取1 mL培養(yǎng)液3 000 rmp/s離心后，棄上清，加入1 mL生理鹽水，振蕩混勻，100倍稀釋。

試驗組和對照組各隨機挑取15尾黑莓鱸。試驗組腹腔注射菌液0.2 mL/尾，對照組腹腔注射生理鹽水0.2 mL/尾。試驗期間水溫27.0±0.5 ℃，連續(xù)7 d觀察并記錄各組魚的發(fā)病和死亡情況。并對死亡黑莓鱸及時進行解剖和病原菌的再次分離。采取平板落菌的方法，計算得菌液濃度約為4.0×108cfu/mL。

2.4.2 半致死濃度

根據(jù)文獻［3-4］中測定方法，隨機挑選105尾黑莓鱸，分7組，6個實驗組，1個對照組，每組各15尾。

將細菌純化培養(yǎng)物按2.4.1的方法制得后，用無菌生理鹽水洗滌并制成細菌懸液，菌液濃度為：1× 103cfu/mL、1×104cfu/mL、1×105cfu/mL、1×106cfu/mL、1×107cfu/mL、1×108cfu/mL，每尾注射0.2 mL，對照組每尾注射生理鹽水0.2 mL。試驗期間水溫保持在27.0±0.5 ℃，連續(xù) 7 d觀察并記錄各組魚的發(fā)病和死亡情況，及時清除死亡個體。

2.5 病原菌鑒定

2.5.1 生理生化鑒定

用接種環(huán)和接種針挑取單菌落，分別進行AHM試驗，細菌的動力試驗，氧化酶試驗，葡萄糖、蔗糖等生化鑒定試驗，用BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進行鑒定。

2.5.2 16S rRNA 序列同源性分析

取純化后的細菌，通過核酸抽提，PCR擴增，電泳，切膠回收后，將回收產(chǎn)物送華大基進行測序。通過已測得的序列與GenBank中臨近種屬的16S rRNA 序列進行相似性比對，確定其物種。

2.5.3 序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

采用GenBank數(shù)據(jù)庫中Blast軟件對測序得到序列進行相似性比較。采用MEFA 4.0 軟件進行多重序列匹配分析，用鄰接發(fā)（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)集為1 000。

2.6 藥物敏感試驗

藥敏試驗采用K-B瓊脂法。將制成的2.0×108cfu/ mL菌懸液，取0.1 mL，用涂布棒均勻涂布于NA平板上。用無菌鑷子將抗生素紙片緊貼在平板表面，于28 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h。記錄各藥敏紙片抑菌圈的直徑，根據(jù)藥敏紙片的抑菌范圍解釋標準判斷試驗結(jié)果。

3　結(jié)果與分析

3.1 病原菌菌落形態(tài)特征

在NA平板上菌落呈圓形、淡黃色不透明，表面濕潤、光滑、微隆起、邊緣整齊，直徑為1～3 mm。在血瓊脂平板上呈灰白色，不溶血。鏡檢可見紅色短直桿菌，兩端鈍圓，多單個散開分布。

3.2 回歸感染試驗

如表1所示，分離菌株對黑莓鱸有較強的致病性，人工感染玫瑰鱸的死亡率為100%。與養(yǎng)殖場病魚的癥狀相同，將病魚送回實驗室進行檢測，再次分離到相同的病原菌。

表1 B017對健康黑莓鱸人工感染試驗結(jié)果

3.3 半致死濃度試驗

根據(jù)表1中魚的死亡結(jié)果，用 SPSS 13.0 計算 B017 得 LD50=2.6×104cfu/g。

3.4 生化鑒定結(jié)果

AHM培養(yǎng)基鑒定為陽性，運動力陽性，氧化酶試驗陽性，吲哚試驗陽性，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷及水楊苷等5種糖類，脫脂奶平板試驗陰性，經(jīng)BD PhoenixTM-100全自動細菌鑒定/藥敏系統(tǒng)鑒定，B017為類志賀鄰單胞菌（鑒定率為99.9%，T值為0.95，鑒定結(jié)果極好）。

3.5 基于16S rRNA基因序列同源性去頂菌株B017的系統(tǒng)發(fā)育地位

用16S rRNA通用引物擴增B017 菌株的16S rRNA基因片段，得到一長度約為1 500 bp的片段。所測基因序列（登錄號：KC825332）與已登陸的類志賀鄰單胞菌16S rRNA相應(yīng)基因序列的同源性為98%～99%，從中選擇同源性較高的類志賀鄰單胞菌以及弧菌科其它菌屬細菌16S rRNA 基因序列，并以柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）為外群，用MEGA 4.0 軟件通過鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)B017與類志賀鄰單胞菌聚為一簇。

3.6 藥敏試驗結(jié)果

用35種常用的抗生素藥物對菌株B017進行藥物敏感性試驗，試驗結(jié)果顯示：該菌株對氨曲南等26種抗生素敏感，對氨芐西林等5種抗生素中介，對麥迪霉素等4種抗生素耐藥（如表2所示）。

表2 藥物敏感性試驗

4　討論

日益嚴重的藥物殘留、環(huán)境污染和細菌耐藥問題已成為一個世界關(guān)注的獸醫(yī)公共衛(wèi)生問題。對分離到的該致病菌株耐藥性分析發(fā)現(xiàn)，該菌對氨曲南、頭孢唑啉等藥物敏感，對氨芐西林等中介，對克林霉素、萬古霉素耐藥。該結(jié)果與陸文浩等［7］和陳林等［8］的試驗結(jié)果不同：陸文浩等分離的菌株對頭孢唑林、頭孢呋辛和四環(huán)素均中介；陳林等分離的菌株對復(fù)方新諾明耐藥，對四環(huán)素、阿米卡星和慶大霉素等中介。這些菌株間的耐藥性差異可能與分離地方不同、環(huán)境不同或者宿主不同有關(guān)，也可能是抗生素濫用的結(jié)果，這勢必為類志賀鄰單胞菌疾病的防治帶來不利影響。

［1］李耀國，肖調(diào)義.轉(zhuǎn)基因抗病草魚研究進展［J］.生物技術(shù)通報，2011，（1）：26-28.

［2］沈建忠.動物毒理學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

（編輯：晏兵兵）

S435.111.47

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1006-799X（2016）13-0126-03