郭曉蘭李秀娟楊文彪黃芳儀

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·病例報告·

銀屑病患者外周血Th17/Th22細(xì)胞的表達(dá)

郭曉蘭1李秀娟2楊文彪1黃芳儀1

目的： 檢測尋常型銀屑病（PV）患者外周血Th17、Th22的水平及相關(guān)因子IL-17、IL-22、IL -6的血清水平。方法： PASI評分評估患者病情，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測40例PV患者和30例健康對照者外周血Th17和Th22細(xì)胞，ELISA法檢測血清中IL-17、IL-22和IL-6水平。結(jié)果： PV患者Th17細(xì)胞及Th22細(xì)胞，血清IL-17、IL-22及血清IL-6的水平明顯高于健康對照組（P均＜0.01），且與PASI呈正相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論： Th17和Th22可能參與銀屑病的發(fā)病。

銀屑?。?輔助性T細(xì)胞17； 輔助性T細(xì)胞22

近年來發(fā)現(xiàn)兩種新型的不同于Th1和Th2細(xì)胞的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞——Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞，兩者都具有獨(dú)立的分化和發(fā)育機(jī)制。Th17細(xì)胞特異性地產(chǎn)生IL-17、IL-22等效應(yīng)因子，Th22細(xì)胞主要分泌IL-22，介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)生和發(fā)展。我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測40例銀屑病（PV）患者和30例健康對照者外周血Th17和Th22細(xì)胞，并用ELISA法檢測血清中IL-17、IL-22、IL-6水平，探討Th17/Th22細(xì)胞及相關(guān)因子與PV的關(guān)系。

1　病例與方法

1.1病例資料和材料 病例選自2015年6～8月我科門診及住院患者，共40例，其中男23例，女17例，年齡14～66歲，平均30.1±13.38歲。病程1～25年，平均9.86±5.96年，PASI評分為3.7～19.8，平均11.7 ±4.68，均為進(jìn)行期尋常型銀屑病，所有患者均經(jīng)臨床或病理確診，近1個月未作局部治療，近2個月未接受任何系統(tǒng)治療及紫外線照射治療。伴有活動性肺結(jié)核、甲亢、心肝腎功能不全、皮膚腫瘤、女性患者在妊娠期均被排除。選擇30位健康人作為正常對照組，其中男18位，女12位，年齡15～64歲，平均32.3± 10.98歲，與病例組比較，年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

儀器與試劑流式細(xì)胞儀器為 Beckman Coulter EPICS XL產(chǎn)品；單克隆熒光直標(biāo)抗體鼠抗人IL-17-FITC、IL-22-FITC及CD4-Pecy5為美國Biolegend公司產(chǎn)品及相應(yīng)的同型對照FITC標(biāo)記鼠IgG1、Pecy5標(biāo)記鼠IgG1；固定劑及破膜劑（FIX&PERM Caltag公司）；RPMI1640、PMA、Ionomycin和Monensin（Sigma公司）。美國產(chǎn)BB5060型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；ELISA試劑盒購自杭州聯(lián)科生物有限公司。

1.2方法

1.2.1流式細(xì)胞術(shù)檢測Th17/Th22 無菌抽取靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉充分抗凝。按一定的比例進(jìn)行全血細(xì)胞刺激培養(yǎng)4 h（全血細(xì)胞刺激培養(yǎng)：每管加入0.5 mL無血清的RPMI 1640培養(yǎng)液、0.5 mL枸櫞酸鈉抗凝的全血和終濃度為25 ng/mL的PMA、1 μg/ mL的 Ionomycin、20 ng/mL的 Monensin，混勻后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h）。培養(yǎng)后的全血細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后，分成3管，分別加10 μL抗CD4+抗體進(jìn)行表面染色，混勻后室溫暗處放置30 min；加固定劑50 μL，室溫放置15 min，加入4 mL PBS洗滌，1500 r/min，離心10 min，去上清液；加通透劑30 μL，3管分別加入抗IL-17抗體、抗IL-22抗體及FITC抗體同種型對照，混勻后室溫暗處放置15 min，用相配套溶血素溶血，洗滌1次，去上清液，加PBS 500 μL配成1.0×107/L的細(xì)胞懸液，待上機(jī)檢測。

1.2.2ELISA檢測血清IL-6、IL-17、IL-22 用促凝管采空腹靜脈血2 mL，3000 rpm，10 min分離上清液，取足夠上清液于離心管中，-70℃保存，備用，避免反復(fù)凍融，操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 所用數(shù)據(jù)使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

圖1　a，b：PV患者及正常對照組外周血Th17細(xì)胞流式儀檢測圖

圖2　a，b：PV患者及正常對照組外周血Th22細(xì)胞流式儀檢測圖

2.1PV患者外周血Th17/Th22細(xì)胞表達(dá)水平的檢測結(jié)果 PV患者外周血Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞分別為（2.78±1.93）%和（2.38±0.64）%均明顯高于對照組的（0.98±0.56）%和（0.94±0.43）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），見圖1和圖2。 2.2 Th17/Th22細(xì)胞與血清中細(xì)胞因子表達(dá)水平的相關(guān)性 40例PV患者血清中IL-17、IL-22及IL-6濃度分別為（23.85±7.98）pg/mL、（69.22±3.18）pg/ mL及（30.52±2.58）pg/mL，明顯高于對照組的（6.53± 4.26）pg/mL、（39.05±3.50）pg/mL及（15.21±1.72）pg/mL，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.3Th17/Th22細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子與PASI相關(guān)性分析 PV患者Th17、Th22、IL-17、IL-22及IL-6水平高低同PASI評分呈正相關(guān)（r=0.79、0.73、0.49、0.52、0.48，均P＜0.05）。

3　討論

銀屑病是一種多基因遺傳背景下的慢性炎癥性皮膚病，以角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖和異常分化及炎性細(xì)胞浸潤為主要特征。目前在銀屑病發(fā)病機(jī)制中，Th細(xì)胞亞群及其細(xì)胞因子在銀屑病中的作用得到廣泛關(guān)注。Th17細(xì)胞是一種新型Th細(xì)胞亞群，參與誘導(dǎo)自身免疫，特異性產(chǎn)生IL-17。具有獨(dú)立的分化和發(fā)育機(jī)制，TGF-β和IL-6聯(lián)合作用促進(jìn)其分化，IL-23促進(jìn)其增殖和存活，Th1和Th2細(xì)胞因子及IL-27則抑制其分化。孤獨(dú)受體（RORγt）是控制其分化的轉(zhuǎn)錄因子。Th17細(xì)胞特異性地產(chǎn)生IL-17、IL-22等效應(yīng)因子，介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病等的發(fā)生和發(fā)展［1，2］。蘇彤等［3］研究顯示銀屑病患者血清 IL-17、IL-23 mRNA水平非常顯著地高于正常對照組。IL-17/IL-23是多種自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制的重要炎癥因子，IL-23主要由抗原提呈細(xì)胞及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖產(chǎn)生IL-17，在IL-17介導(dǎo)的炎性疾病中IL-23起著重要的作用，IL-23通過與IL-23R結(jié)合發(fā)揮作用，IL-23R幾乎存在于所有的分泌IL-17的細(xì)胞表面。IL-23R、IL-17參與了銀屑病的發(fā)病機(jī)制。Th22細(xì)胞是繼Th17細(xì)胞亞群后，發(fā)現(xiàn)的又一效應(yīng)T細(xì)胞亞群，表明了T細(xì)胞亞群的多樣性。Th22細(xì)胞主要分泌IL-22，還可分泌IL-10、IL-13、IL-26、腫瘤壞死因子（TNF）-α等細(xì)胞因子。其功能主要是通過IL-22來實(shí)現(xiàn)的［4］。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-23或IL-6均可誘導(dǎo)刺激IL-22的表達(dá)。在漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞刺激下，IL-6和TNF-α可以促進(jìn)CD4+T初始細(xì)胞向Th22型細(xì)胞的分化。IL-22的靶細(xì)胞主要是上皮細(xì)胞，而IL-23的主要靶細(xì)胞是免疫細(xì)胞，IL-22很可能是IL-23的重要下游效應(yīng)分子，并在銀屑病病灶組織中介導(dǎo)免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞等上皮細(xì)胞間的相互作用［5］。研究證明IL-22與銀屑病顯著相關(guān)［6-8］。且其在銀屑病患者的血清和皮損中的水平隨著疾病嚴(yán)重程度增加而升高，因而被稱為銀屑病前炎癥因子［9］。

本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測銀屑病患者和健康對照者外周血Th17和Th22細(xì)胞，并用ELISA法檢測血清中IL-17、IL-22、IL-6水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者外周血Th17及Th22細(xì)胞的百分比，血清中IL-17、IL-22、IL-6水平都較正常人升高。相關(guān)性分析表明，Th17、Th22、IL-17、IL-22及IL-6水平高低同PASI評分呈正相關(guān)，隨著PASI評分增高，其表達(dá)量隨之升高，提示Th17細(xì)胞通過分泌IL-17、IL-22，Th22細(xì)胞分泌IL-22而參與銀屑病的發(fā)病。IL-6促進(jìn)Th17分化，IL-23促進(jìn)其增殖和存活，而IL-23或IL-6均可誘導(dǎo)刺激IL-22的表達(dá)。各類細(xì)胞亞群之間互相調(diào)控，使機(jī)體處于一種精細(xì)而復(fù)雜的平衡狀態(tài)。深入研究Th17和Th22細(xì)胞的分化、生理和病理功能以及調(diào)控機(jī)制，對T細(xì)胞亞群的研究和皮膚疾病病理機(jī)制的研究都具有理論和實(shí)際意義。

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（收稿：2015-12-21）

Expression of Th17 and Th22 in patients with psoriasis vulgaris

GUO Xiaolan1，LI Xiujuan2，YANG Wenbiao1，HUANG Fangyi1.
1.Department of Dermatology，the Central Hospital of Jiangmen，Jiangmen 529030，Guangdong，China；2. Department of Clinical Laboratory，the Central Hospital of Jiangmen，Jiangmen 529030，Guangdong，China Corresponding author：YANG Wenbiao，E-mail：yangwenbiao@medmail.com.cn

Objective：To detect the level of Th17 and Th22 and the expression of related cytokines including IL-17，IL-22 and IL-6 in of the patients with psoriasis vulgaris.Methods：The disease severity was evaluated by PASI scores.The levels of peripheral blood Th17 and Th22 cells in 40 patients and 30 healthy controls were detected by flow cytometry.The levels of serum IL-17，IL-22 and IL-6 were detected by ELISA.Results：The levels of Th17，Th22，IL-17，IL-22 and IL-6 in the patients with psoriasis vulgaris were higher than those in healthy controls（P＜0.01）and were positively correlated with PASI scores（P＜0.05）.Conclusion：Th17 and Th22 cells may be involved in the pathogenesis of psoriasis vulgaris.

psoriasis；Th17 cell；Th22 cell

楊文彪，E-mail：yangwenbiao@medmail.com.cn

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助（編號：A2014782）

1江門市中心醫(yī)院皮膚科，廣東江門，529030

2江門市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東江門，529030