張　涵， 張秀霞， 尚瓊瓊， 鄭紅婷， 劉國臣

(中國石油大學 化學工程學院 環(huán)境與安全工程系， 山東 青島 266580)

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秸稈載體腐解對微生物修復石油污染的影響

張涵， 張秀霞， 尚瓊瓊， 鄭紅婷， 劉國臣

(中國石油大學 化學工程學院 環(huán)境與安全工程系， 山東 青島 266580)

摘要：以一種農(nóng)作物秸稈(簡稱MG)為載體，采用高效石油烴降解菌群制備固定化微生物，在花盆中模擬石油污染土壤的原位修復。在污染土壤中分別加入秸稈(MG)、游離菌、秸稈(MG)+游離菌、秸稈(MG)固定化微生物，并以只含土著菌的土壤樣品為對照，定期測定不同修復方式下土樣中石油烴、腐殖質(zhì)、胡敏酸含量和微生物數(shù)量，考察微生物對石油污染土壤的修復作用及MG腐解對修復的影響。結(jié)果表明，隨著修復的進行， MG在土壤中逐漸腐解，土壤中腐殖質(zhì)和胡敏酸質(zhì)量分數(shù)明顯增高，加入固定化微生物的土樣中腐殖質(zhì)和胡敏酸質(zhì)量分數(shù)增長率最高，分別增加了44.58%和39.27%；加入固定化微生物的土樣修復35 d的石油烴降解率最高，達到41.78%，且微生物數(shù)量最多，其次為添加MG+游離菌的土樣，石油烴降解率為 31.75%，均高于只含游離菌土樣的石油烴降解率27.83%。載體MG腐解產(chǎn)生的腐殖質(zhì)和胡敏酸對石油污染土壤的修復起到了明顯的促進作用。

關鍵詞：秸稈；固定化微生物；石油污染土壤；腐解

在石油資源的大規(guī)模和高強度的開采、儲運和加工過程中，因操作管理不當?shù)戎T多因素，易造成土壤的石油污染，嚴重影響土壤的理化性質(zhì)[1]和生物特性[2]。微生物應用于石油污染土壤修復的效果明顯。傳統(tǒng)微生物修復技術多采用游離菌，存在單位體積內(nèi)有效降解菌濃度低、與土著菌競爭處于弱勢、抗毒性侵害能力差等缺點[3]。固定化微生物技術[4]克服了傳統(tǒng)微生物修復技術的缺點，在石油污染土壤的治理方面顯示出獨特的優(yōu)勢[5]。

秸稈載體固定化微生物因其載體材料的化學組成、結(jié)構(gòu)特性、腐解特性[6-7]，可以有效吸附高效石油烴降解菌及石油污染物，并提高土壤肥力[8]，改善土壤環(huán)境。近年來，對秸稈固定化微生物修復石油污染土壤的研究逐漸深入[9-11]，但作為固定化的載體，秸稈腐解對固定化微生物修復石油污染土壤的影響尚不明確。

筆者采用一種農(nóng)作物秸稈(簡稱MG)作為載體，利用吸附法制備固定化微生物，通過花盆實驗模擬秸稈固定化微生物對石油污染土壤的修復，并設置加入秸稈、游離菌、秸稈+游離菌的實驗組，研究秸稈載體的腐解特性、微生物數(shù)量與修復效率之間的關系，以探究秸稈載體對微生物修復石油污染土壤的影響。

1　實驗部分

1.1材料

土壤樣品，取自勝利油田石油污染土壤，pH值為7.28，含水質(zhì)量分數(shù)為2.70%，石油烴質(zhì)量分數(shù)為4.19%，腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為10.24 g/kg。將土壤中的植物殘體和碎石除去，過3 mm篩后，風干備用。

秸稈MG，粉碎后過40目篩，滅菌，備用。

高效石油烴降解菌H3和H4，從勝利油田石油污染土壤中篩選出，其在原油培養(yǎng)基中的5 d石油烴降解率分別達到31.48%和37.56%； H3和H4的活化菌液體積比為3/2時，5 d石油烴降解率最高，達47.50%，所以以該比例構(gòu)建混合菌液N。

1.2固定化微生物的制備及載體生物量的測定

采用高效混合菌液N，以粉碎過篩的秸稈MG為載體，吸附法制備固定化微生物。采用平板稀釋涂布法計算載體生物量，同時取1 mL游離菌，以相同方法進行計數(shù)，計算1 g固定化微生物與游離菌的對應微生物量。得到固定化微生物MG材料吸附細菌數(shù)目為1.25×1010個/g，游離菌液細菌數(shù)量為2.66×1010個/mL，等量換算關系為1.25×1010/2.66×1010=0.47(mL/g)，即1 g固定化微生物對應0.47 mL游離菌液所含的生物量。

1.3土壤和秸稈性質(zhì)的測定

采用超聲萃取-紫外分光光度法進行測定石油烴質(zhì)量分數(shù)[12]；采用焦磷酸鈉-氫氧化鈉浸提法(LY/T 1238-1999)測定腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)；采用重鉻酸鉀氧化外加熱法(LY/T 1238-1999) 測定胡敏酸質(zhì)量分數(shù)；采用平板稀釋涂布法[13]測定微生物數(shù)量。

1.4石油降解率的計算

從降解前后的石油烴質(zhì)量分數(shù)w0和w1，按式(1)計算得出石油烴降解率η。

(1)

1.5秸稈固定化微生物修復石油污染土壤的花盆模擬實驗

將石油污染土壤分別置于10個花盆中，每盆500 g土壤。按照實驗室前期工作得出的最佳降解條件[14]，調(diào)節(jié)土壤中C、N、P的質(zhì)量比為100∶5∶1，并調(diào)節(jié)含水率在17%左右，對石油污染土壤按照表1的5種修復方式進行實驗。其中固定化微生物的添加量為15%，游離菌液添加量為實驗得出的與固定化微生物的生物量相等時的體積，秸稈添加量為與固定化微生物載體相同質(zhì)量。

將花盆置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中進行35 d修復實驗，每天對土壤進行補水、翻耕，按照四分法取樣分析，取3組平行樣測定結(jié)果平均值。每隔7 d測定各花盆中土壤的石油烴、腐殖質(zhì)、胡敏酸的質(zhì)量分數(shù)和微生物數(shù)量。

表1　石油污染土壤的不同修復方式

“+”— Added；“-”— Not added

2　結(jié)果與討論

2.1石油污染土壤修復過程中石油烴降解率

采用表1所列不同處理方式修復石油污染土壤35 d過程中，石油烴降解率隨時間的變化如圖1所示。由圖1可以看出，添加固定化微生物的5#土樣35 d修復的累積石油烴降解率最高，達到41.78%，比只含游離菌的3#土樣石油烴降解率高13.95百分點。這是由于固定化細胞顆粒的微環(huán)境能有效屏蔽土著菌、噬菌體和毒性物質(zhì)對微生物的惡性競爭、吞噬和毒害，使其在復雜環(huán)境中也可穩(wěn)定地發(fā)揮高效能[3]。其次是添加秸稈+游離菌的4#土樣，其累積石油烴降解率達31.75%，比只含游離菌的3#土樣石油烴降解率高3.92百分點。

圖1　不同方式修復石油污染土樣的石油 烴降解率(η)隨時間的變化Fig.1　Petroleum hydrocarbon degradation rate(η) vs remediation time of petroleum contaminated soil samples with different restoration methods

在修復初期，同時添加秸稈和游離菌對污染土壤的修復作用比只添加游離菌的修復作用明顯，因為秸稈的加入在一定程度上能降低土壤容重[15-16]，利于石油烴降解菌的呼吸和繁殖，從而促進石油烴的降解。隨著修復時間的增長，添加的秸稈在土壤中發(fā)生腐解，轉(zhuǎn)化成土壤的重要成分——有機質(zhì)[17]，能夠改良土壤結(jié)構(gòu)，改善土壤理化性質(zhì)[18]，為微生物提供良好的生長環(huán)境，促進石油烴降解菌發(fā)揮降解效能。對于添加秸稈的2#土樣，35 d 修復得到的累積石油烴降解率為7.79%，高于只含有土著菌的1#土樣，可見秸稈的添加能夠提高土著菌的降解效率。

2.2秸稈MG在石油污染土壤修復過程中的腐解

2.2.1土壤修復過程中腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)的變化

在石油污染土壤修復過程中，對腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)進行定期測定，結(jié)果示于圖2。

圖2　不同修復方式下石油污染土樣中腐殖質(zhì) 質(zhì)量分數(shù)隨時間的變化Fig.2　Mass fraction of humic substances in oil contaminated soils vs remediation time under different restoration methods

由圖2可以看出，除只含土著菌的1#土樣外，其他處理方式下土樣的腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)均隨著時間的增長而增加。其中以添加固定化微生物的5#土樣的腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)增加最多，由11.17 g/kg增長到16.61 g/kg，增加44.58%。添加秸稈+游離菌的4#土樣和添加秸稈的2#土樣中的腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)增加也較明顯。結(jié)合圖1可以看出，添加秸稈的2#土樣累積石油烴降解率比只含土著菌的1#土樣的降解率高3.45百分點，這是由于秸稈在土壤中的腐解產(chǎn)生腐殖質(zhì)，腐殖質(zhì)與土壤膠粒形成的有機-無機復合膠體，能夠進一步增強對石油烴污染物的吸收，從而增加石油烴降解菌的效率，同時能夠進行氧化還原反應，將石油烴氧化，促進其降解。

添加秸稈+游離菌的4#土樣比只含游離菌的3#土樣的累積石油烴降解率高3.92百分點，這是由于秸稈腐解產(chǎn)生的腐殖質(zhì)增加了土壤中微生物的活性，腐殖質(zhì)中多種功能基團的存在，增強了土壤過氧化氫酶[18]、脫氫酶[19]的活性，以及降解菌的新陳代謝作用的結(jié)果。

修復進行21 d后，添加秸稈的2#土樣、添加秸稈+游離菌的4#土樣和添加固定化微生物的5#土樣的腐殖質(zhì)產(chǎn)生速率逐漸增高。一方面，由于隨著石油烴的降解，土壤的石油烴含量逐漸降低，有利于土壤中有益微生物的繁殖生長，土壤中能夠腐解秸稈的微生物的活性增強，對秸稈的腐解速率增加；另一方面，秸稈表面難以腐解的蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)在前期的腐解中被破壞，表面松散，與外界的接觸面積增大，更易被腐解。

2.2.2土壤修復過程中胡敏酸質(zhì)量分數(shù)的變化

胡敏酸中含有多種活潑的功能基團[20]，其中羧基、羥基等官能團可與土壤中的石油烴發(fā)生相互作用，影響石油烴的環(huán)境行為。不同修復方式下石油污染土樣中胡敏酸質(zhì)量分數(shù)隨時間的變化示于圖3。

圖3　不同修復下石油污染土樣的胡敏酸質(zhì)量 分數(shù)隨時間的變化Fig.3　Mass fraction of humic acid in oil contaminated soils vs remediation time under different remediation methods

結(jié)合圖2和圖3可以看出，胡敏酸作為腐殖質(zhì)的組成之一，在石油污染土壤的修復過程中其質(zhì)量分數(shù)的變化趨勢與腐殖質(zhì)的大致相同。圖3顯示，與只含土著菌的1#土樣相比，添加固定化微生物的5#土樣修復35 d時，胡敏酸質(zhì)量分數(shù)的變化最大，增加了39.27%；添加秸稈+游離菌的4#土樣 的胡敏酸質(zhì)量分數(shù)增加了31.93%，比只添加游離菌的3#土樣的胡敏酸質(zhì)量分數(shù)增加26.11%；添加秸稈的2#土樣的胡敏酸質(zhì)量分數(shù)也比只含土著菌的1#土樣的高27.66%。由此可以看出，秸稈的加入顯著增加了土壤中胡敏酸的質(zhì)量分數(shù)。秸稈的腐解有利于土壤中石油烴的降解，同時，土壤中石油烴污染物的減少為秸稈的腐解提供了相對較好的環(huán)境，二者相互促進，達到修復石油污染土壤的目的。

2.2.3土壤修復過程中微生物數(shù)量

在微生物對石油污染土壤的修復過程中，微生物的數(shù)量是影響修復的關鍵因素。對修復過程中土壤中微生物數(shù)量進行定期測定，結(jié)果示于圖4。

圖4　不同修復方式下石油污染土樣中微生物數(shù)量 隨時間的變化Fig.4　Microbial number of petroleum contaminated soils vs remediation time under different restoration methods

由圖4可以看出，在修復過程中，各修復方式下的土樣中微生物的數(shù)量均有所增加。加入游離菌、秸稈+游離菌、固定化微生物的土樣中，微生物的初始數(shù)量明顯高于加入秸稈和只含土著菌的土樣的，說明外源菌的加入能夠明顯增加土壤中的微生物數(shù)量。其中固定化微生物因其適應能力強，死亡率較低，故其對土壤微生物數(shù)量的增加效果最為明顯。

修復初期，添加秸稈的2#土樣的微生物數(shù)量比只含土著菌的1#土樣微生物數(shù)量多，這是由于秸稈的加入，增加了土壤的孔隙度，利于微生物的有氧呼吸和代謝，從而促進了有益微生物的生長繁殖[21]。隨著修復的進行，添加秸稈、添加秸稈+游離菌和添加固定化微生物的土樣中的秸稈發(fā)生腐解，產(chǎn)生的腐殖質(zhì)能夠與其中的有機污染物和重金屬等有毒物質(zhì)結(jié)合形成團粒[22]而降低毒性；同時，秸稈的添加增加了土壤中的N、P等營養(yǎng)物質(zhì)，被微生物所利用，從而促進了土壤中微生物的生長。其中添加固定化微生物的5#土樣由于固定化微生物的修復效率最高，土壤的環(huán)境得以明顯改善，微生物數(shù)量最多，并保持穩(wěn)定增長。

2.3土壤腐解特性、微生物數(shù)量與石油烴降解率的相關性

采用SPSS19.0方法分析了土壤中秸稈腐解特性、微生物數(shù)量與石油烴降解率的相關性，結(jié)果列于表2。

表2　土壤中腐殖酸質(zhì)量分數(shù)、微生物數(shù)量與石油烴降解率的相關性

1) The correlation is significant at the 0.05 level.

由表2可以看出，與腐殖質(zhì)質(zhì)量分數(shù)相比，微生物數(shù)量與石油烴的降解率相關性較高。結(jié)合圖1～圖4可以看出，添加游離菌的3#土樣的累積石油烴降解率和微生物數(shù)量均明顯高于只添加秸稈的2#土樣，而腐殖質(zhì)和胡敏酸質(zhì)量分數(shù)卻低于2#土樣。可見，在土壤石油烴的降解過程中，與秸稈腐解產(chǎn)生的腐殖質(zhì)相比，高效石油烴降解菌所發(fā)揮的作用較大；同時，秸稈的加入能夠增加土壤中的腐殖質(zhì)和胡敏酸質(zhì)量分數(shù)，提高石油烴降解率。因此，秸稈腐解所產(chǎn)生的腐殖質(zhì)能夠?qū)π迯推鸬矫黠@的促進作用。

3　結(jié)　論

(1)秸稈作為載體對微生物修復石油污染土壤有明顯的促進作用。經(jīng)秸稈固定化微生物、秸稈+游離菌修復35 d的土壤中，石油烴降解率分別達到41.78%、31.75%，比只有游離菌修復的土壤分別提高13.95和3.92百分點。

(2)秸稈固定化微生物的加入提高了石油污染土壤的腐殖質(zhì)和胡敏酸的質(zhì)量分數(shù)，有利于石油污染土壤的修復。

(3)經(jīng)過相關性分析，在石油污染土壤的修復過程中，降解菌的存在發(fā)揮主導作用，秸稈腐解所產(chǎn)生的腐殖質(zhì)能夠明顯促進石油污染土壤的修復，秸稈固定化微生物修復效率高是二者共同作用的結(jié)果。

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收稿日期：2015-07-13

基金項目：山東省自然科學基金項目(ZR2014BM023)、中國石油科技創(chuàng)新基金項目(2009D-5006-07-01)、青島市科技發(fā)展指導計劃項目(KJZD-12-65-jch)、中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(11CX05011A)、中國石油大學(華東)研究生創(chuàng)新工程(CX-1219)、(CX2013035)、研究生金點子項目(JDZ1405030)和中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(14CX06101A)資助

文章編號：1001-8719(2016)04-0767-06

中圖分類號：TE991.3

文獻標識碼：A

doi:10.3969/j.issn.1001-8719.2016.04.016

Effect of Straw Carrier Decomposition on Remediation of Petroleum Contaminated Soil by Microorganism

ZHANG Han，ZHANG Xiuxia，SHANG Qiongqiong，ZHENG Hongting，LIU Guochen

(DepartmentofEnvironmentalandSafetyEngineering,CollegeofChemicalEngineering,ChinaUniversityofPetroleum,Qingdao266580,China)

Abstract：The immobilized microorganism was prepared by highly efficiency petroleum hydrocarbon degrading bacteria and straw carrier material MG, and used to simulate the in situ remediation of petroleum contaminated soil. The MG, free bacteria, MG plus free bacteria, immobilized microorganism were added into petroleum contaminated soil, respectively, and a control group containing only indigenous bacteria was set up. The content of petroleum hydrocarbons, humic substances, humic acid and the microbe quantity in the soil of different remediation methods were determined at set intervals to investigate the effect of microorganism on petroleum contaminated soil and the effect of MG decomposition on the remediation. The results showed that MG in the soil gradually decomposed along with the restoration, causing the increases of humic substances and humic acid contents in soil obviously. The increasing rates of humic substances and humic acid mass fraction of petroleum contaminated soil with the addition of immobilized microorganism were 44.58% and 39.27%, respectively, both were the highest values among these remediation methods. The highest degradation rate of 41.78% for 35 d remediation of petroleum contaminated soil with immobilized microorganism and the most microorganism number were obtained, and next one was the petroleum contaminated soil containing MG plus free bacteria, with the petroleum hydrocarbon degradation rate of 31.75%, higher than 27.83% of the petroleum contaminated soil containing free bacteria added only. Humic substances and humic acid produced in decomposition of MG have significant effect on the remediation of oil contaminated soil.

Key words：straw; immobilized microorganism; petroleum contaminated soil; decomposition

第一作者：張涵，女，碩士研究生，從事石油污染土壤修復研究工作

通訊聯(lián)系人：張秀霞，女，教授，博士，從事石油污染土壤修復研究工作； E-mail:zhxiuxia@upc.edu.cn