劉曙光，鄒振寧，馬紅梅，王新根，李　靜，徐勝美

(1.廣東省深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院病理科　518033；2.廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東湛江 524023)

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CD147和PTEN在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及與臨床病理因素的相關(guān)性分析*

劉曙光1，鄒振寧2，馬紅梅1，王新根1，李靜1，徐勝美1

(1.廣東省深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院病理科518033；2.廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，廣東湛江 524023)

目的分析細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(CD147)和第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(PTEN)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)，并探討兩者的相關(guān)性及其蛋白表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理因素的關(guān)系。方法采用免疫組織化學(xué)鏈霉素標(biāo)記生物素過(guò)氧化物酶法(SP法)檢測(cè)64例NSCLC患者組織中CD147和PTEN的表達(dá)情況，另選取10例患者的癌旁正常肺組織作為對(duì)照，并分析CD147和PTEN表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果CD147在NSCLC組織中的表達(dá)率(75.00%)明顯高于癌旁正常肺組織(0.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CD147蛋白表達(dá)與肺癌組織分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)(P<0.05)。PTEN在肺癌組織中的表達(dá)率(32.81%)明顯低于癌旁正常肺組織(80.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。PTEN表達(dá)與TNM分期相關(guān)(P<0.05)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示NSCLC組織中CD147和PTEN表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.442，P<0.05)。結(jié)論CD147和PTEN異常表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。

非小細(xì)胞肺癌；免疫組織化學(xué)；細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子；第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白

肺癌是全球范圍內(nèi)腫瘤相關(guān)死亡的首位原因，非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌總數(shù)的80%[1]。NSCLC的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其進(jìn)展涉及眾多癌基因和抑癌基因。細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN/CD147)與第10號(hào)染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)在很多腫瘤中表達(dá)異常，且與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)。本研究分析了CD147和PTEN在NSCLC的表達(dá)情況，并探討二者的關(guān)系及蛋白表達(dá)水平與多個(gè)臨床病理因素的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料收集廣東省深圳市福田區(qū)人民醫(yī)院2008年6月至2010年8月因NSCLC行肺葉切除的64例患者的病理活檢標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療。其中男46例，女18例；<60歲者34例，≥60歲者30例；有吸煙史者38例，無(wú)吸煙史者26例；鱗狀細(xì)胞癌18例，腺癌40例，大細(xì)胞癌6例；高分化22例，中低分化42例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移39例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期40例，Ⅲ+Ⅳ期24例。另選取同期10例患者的癌旁正常肺組織作為對(duì)照。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)法本組試驗(yàn)病理標(biāo)本均經(jīng)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，然后行4 μm厚切片，每份標(biāo)本均同時(shí)行免疫組織化學(xué)染色與蘇木素-伊紅(HE)染色以判定染色部位。CD147和PTEN表達(dá)采用免疫組織化學(xué)鏈霉素標(biāo)記生物素過(guò)氧化物酶法(SP法)檢測(cè)。CD147羊抗人多克隆抗體為美國(guó)Santa Cruz公司產(chǎn)品，鼠抗人PTEN單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗做陰性對(duì)照，按試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行操作。

1.2.2染色結(jié)果判斷CD147為細(xì)胞膜或胞漿著色，PTEN為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)著色。隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野(×400)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比對(duì)每份切片進(jìn)行綜合評(píng)分，染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞未著色判為0分，淺黃色判為1分，棕黃色判為2分，棕褐色判為3分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞判為0分，<5%判為1分，5%～50%判為2分，>50%判為3分。以染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分之和作為染色結(jié)果進(jìn)行判定，陰性(-)：0～3分；陽(yáng)性(+)：4～6分。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，CD147、PTEN陽(yáng)性表達(dá)率和病理因素的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)，兩蛋白表達(dá)相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1CD147與PTEN在肺組織中的表達(dá)CD147在癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)部位以細(xì)胞膜為主，細(xì)胞質(zhì)也有少量表達(dá)，著色呈黃色或黃褐色，而在正常肺組織中幾乎不表達(dá)(圖1A、B、C)；CD147在NSCLC組織中的表達(dá)率(75.00%)明顯高于癌旁正常肺組織(0.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CD147在大細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的表達(dá)陽(yáng)性率依次為100.00%、83.33%和67.50%。PTEN陽(yáng)性表達(dá)部位以細(xì)胞核為主，細(xì)胞質(zhì)有少量表達(dá)，在正常肺組織中著色呈棕褐色，在癌組織中表達(dá)較弱或不表達(dá)(圖1D、E、F)；PTEN在NSCLC組織中的表達(dá)率(32.81%)明顯低于癌旁正常肺組織(80.00%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：正常肺組織CD147呈陰性表達(dá)；B：肺鱗狀細(xì)胞癌組織CD147呈陽(yáng)性表達(dá)；C：肺腺癌組織CD147呈陽(yáng)性表達(dá)；D：正常肺組織PTEN呈陽(yáng)性表達(dá)；E：肺鱗狀細(xì)胞癌組織PTEN呈陰性表達(dá)；F：肺腺癌組織PTEN呈陽(yáng)性表達(dá)。

圖1CD147在正常肺組織和肺癌組織中的表達(dá)(SP法，×200)

2.2CD147和PTEN表達(dá)與NSCLC臨床病理因素的相關(guān)性CD147蛋白表達(dá)與NSCLC組織分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、吸煙史、組織學(xué)分型無(wú)明顯相關(guān)性。PTEN表達(dá)與TNM分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、吸煙史、NSCLC組織學(xué)分型、分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)明顯相關(guān)性。見(jiàn)表1。

表1　CD147和PTEN表達(dá)與肺癌各項(xiàng)病理 因素的相關(guān)性(n)

續(xù)表1　CD147和PTEN表達(dá)與肺癌各項(xiàng)病理 因素的相關(guān)性(n)

2.3CD147和PTEN在NSCLC中表達(dá)的相關(guān)性64例患者NSCLC組織中，CD147和PTEN同時(shí)表達(dá)陽(yáng)性者10例(15.62%)，同時(shí)表達(dá)陰性者5例(7.81%)，僅CD147表達(dá)陽(yáng)性者38例(59.38%)，僅PTEN表達(dá)陽(yáng)性者11例(17.19%)。采用Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示CD147與PTEN表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.442,P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2　CD147和PTEN蛋白表達(dá)的關(guān)系(n)

3　討　論

隨著對(duì)腫瘤基因的深入研究，人們對(duì)NSCLC的分子發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多個(gè)癌基因和抑癌基因異常與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后有關(guān)，如表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、K-ras、P53等基因。CD147和PTEN作為調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的關(guān)鍵基因，其在包括肺癌在內(nèi)的多種實(shí)體瘤中的作用已受到眾多研究者的關(guān)注。

人類CD147的基因定位于19p13.3，由10個(gè)外顯子組成，編碼相對(duì)分子質(zhì)量為(50～60)×103的跨膜糖蛋白。盡管CD147廣泛分布于體內(nèi)正常組織，但其表達(dá)水平較低，而在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、腎癌等腫瘤細(xì)胞的表面常呈高表達(dá)。研究報(bào)道，CD147過(guò)表達(dá)預(yù)示腫瘤患者預(yù)后較差，是乳腺癌[2]、前列腺癌[3]和食管鱗狀細(xì)胞癌[4]等多種腫瘤的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。有研究表明，CD147可增強(qiáng)肺癌A549細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[5]。本研究結(jié)果顯示，CD147蛋白在肺癌癌旁組織中表達(dá)水平低，均呈陰性，而在肺癌組織中的表達(dá)明顯升高，特別是在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM較高分期(Ⅲ+Ⅳ期)患者的肺癌組織中表達(dá)尤為顯著，而在不同性別、不同年齡和有(無(wú))吸煙史的NSCLC患者間其表達(dá)無(wú)明顯差異。盡管CD147在不同組織學(xué)分型的表達(dá)陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但免疫組織化學(xué)顯示CD147在大細(xì)胞癌、鱗狀細(xì)胞癌和腺癌的表達(dá)陽(yáng)性率依次為100.0%、83.33%和67.50%，這提示不同組織學(xué)類型的肺癌既有聯(lián)系又有明顯的區(qū)別，尤其是在分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)方面。例如各型肺癌均有13q、17q、18q和22p的雜合性丟失；K-ras基因突變見(jiàn)于大約40%的肺腺癌，而少見(jiàn)于其他類型；大約80%的肺鱗狀細(xì)胞癌有EGFR突變；大細(xì)胞癌具有核型復(fù)雜和高度染色體不穩(wěn)定性，除了顯示K-ras、TP53突變和RB通路改變的發(fā)生頻率與其他類型NSCLC相同外，還顯示P16丟失、cyclinD1和cyclinE過(guò)表達(dá)頻率低。筆者推測(cè)，可能由于上述分子遺傳學(xué)的不同，導(dǎo)致CD147在不同類型肺癌中表達(dá)陽(yáng)性率不同。此外，由于腫瘤的異質(zhì)性，同一組織學(xué)類型各亞型中蛋白的表達(dá)也存在差異?？紤]到本試驗(yàn)樣本量有限(如肺大細(xì)胞癌患者僅6例)，難以對(duì)CD147在NSCLC各組織學(xué)類型及其亞型中的表達(dá)規(guī)律做出精確分析，有待擴(kuò)大樣本量再進(jìn)一步分析。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果初步推斷，CD147可能與NSCLC的發(fā)生有關(guān)，而且過(guò)表達(dá)的CD147基因還有可能參與了NSCLC的局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

PTEN位于10q23.3，由9個(gè)外顯子組成。編碼相對(duì)分子質(zhì)量為47×103的蛋白質(zhì)。PTEN具有磷酸酯酶的活性，通過(guò)去磷酸化作用抑制磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidyl inositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/PKB)信號(hào)通路及其下游信號(hào)，從而負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期、增殖、侵襲和遷移，發(fā)揮其抑癌作用。PTEN基因突變和表達(dá)降低可能是腫瘤形成的重要分子事件，促使細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)生改變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[6-8]。相關(guān)研究顯示，PTEN在結(jié)直腸癌、口腔癌、乳腺癌、腎癌等多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)。郅程等[9]應(yīng)用免疫組織化學(xué)定量的方法發(fā)現(xiàn)PTEN在肺癌中的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于正常肺組織。由于PTEN在肺癌各組織學(xué)類型表達(dá)率較低且同樣受樣本量限制，本研究未能對(duì)PTEN在NSCLC各類型及亞型中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行總結(jié)。本研究初步發(fā)現(xiàn)PTEN在肺癌的表達(dá)率明顯低于癌旁正常肺組織，且PTEN蛋白表達(dá)與TNM分期相關(guān)，與文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道一致，說(shuō)明PTEN蛋白失活或表達(dá)降低與NSCLC的進(jìn)展有著密切的關(guān)系。

本研究還顯示，CD147和PTEN表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，提示兩者表達(dá)失調(diào)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能具有協(xié)同作用。研究發(fā)現(xiàn)，CD147可通過(guò)PI3K/PKB信號(hào)通路調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的形成，促進(jìn)腫瘤血管的生成和腫瘤生長(zhǎng)[12]。此外，CD147可刺激腫瘤旁纖維母細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞自身分泌多種基質(zhì)蛋白酶(matrix metallproteases，MMPs)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[13]。值得注意的是，PTEN同樣通過(guò)P13K/PKB信號(hào)通路抑制VEGF表達(dá)及血管生成[14]，并且PTEN還可通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子-kappa B(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號(hào)通路抑制MMPs的表達(dá)[15]。由此可見(jiàn)CD147、PTEN涉及共同的信號(hào)通路，共同促進(jìn)MMPs和VEGF的產(chǎn)生，兩者產(chǎn)生的協(xié)同作用促進(jìn)了NSCLC的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，CD147和PTEN的異常表達(dá)與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，兩者可能存在相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)不僅為相關(guān)信號(hào)通路的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)，而且提示通過(guò)對(duì)兩指標(biāo)的檢測(cè)有助于判斷NSCLC患者的病情進(jìn)展和疾病分期，為尋找NSCLC的預(yù)后指標(biāo)提供了新方向。

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The expression of CD147 and PTEN in non small cell lung cancer and their correlation with clinical pathological factors*

LiuShuguang1，ZouZhenning2，MaHongmei1，WangXingen1，LiJing1，XuShengmei1

(1.DepartmentofPathology,thePeople′sHospitalofFutianDistrict,Shenzhen,Guangdong518033,China;2.DepartmentofPathology,GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang,Guangdong524023,China)

ObjectiveTo analyze the expression of extracellular matrix metalloproteinase inducer(CD147)and phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten(PTEN)in non small cell lung cancer(NSCLC),and to explore the correlations between expressions of CD147 and PTEN and those with clinicopathological factors.MethodsThe expressions of CD147 and PTEN proteins in tissues of 64 cases of patients with NSCLC and 10 cases of normal paracancerous tissues were determined by using immunohistochemical SP method.The correlations between expressions of CD147 and PTEN with clinicopathological factors were analysed,as well.ResultsThe expression of CD147 in NSCLC tissues(75.00%)was significantly higher than that in paracancerous tissues(0.00%,P<0.05).The expression of CD147 was strongly associated with degrees of differentiation,lymph node metastasis and TNM stage(P<0.05).The expression of PTEN in NSCLC tissues(32.81%)was significantly lower than that in paracancerous tissues(80.00%,P<0.05).Expression of PTEN was strongly associated with TNM stage(P<0.05).Spearman correlation analysis shown that CD147 expression was negatively correlated with PTEN expression(r=-0.442,P<0.05).ConclusionThe abnormal expression of CD147 and PTEN might play an important role in the malignant progression of NSCLC.

non small cell lung cancer；immunohistochemistry；extracellular matrix metalloproteinase inducer；phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.015

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金資助項(xiàng)目(A2015429、A2016114)；深圳市福田區(qū)衛(wèi)生公益性科研項(xiàng)目(FTWS2015017)。作者簡(jiǎn)介：劉曙光(1971-)，主治醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

R734

A

1671-8348(2016)19-2638-03

2016-01-08

2016-04-26)