孫鳳軍，洪　海，馮　偉，孫藝璇，夏培元△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶 400038；2.北京總后勤部鄭常莊干休所衛(wèi)生所，北京 100141)

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尿路感染分離金黃色葡萄球菌生物膜形成能力及相關(guān)基因的分析*

孫鳳軍1，洪海2，馮偉1，孫藝璇1，夏培元1△

(1.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥劑科，重慶 400038；2.北京總后勤部鄭常莊干休所衛(wèi)生所，北京 100141)

目的探討尿路感染分離金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力及相關(guān)基因分布，為預(yù)防和治療臨床感染提供理論基礎(chǔ)。方法采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂平板倍比稀釋法檢測最小抑菌濃度，菌落計(jì)數(shù)法檢測細(xì)菌黏附能力，96孔板結(jié)晶紫染色法檢測細(xì)菌生物膜形成能力，生物膜相關(guān)基因檢測采用PCR擴(kuò)增法。結(jié)果11株金黃色葡萄球菌臨床株對青霉素和紅霉素耐藥率較高，而對萬古霉素和呋喃妥因全部敏感。所有菌株都有較強(qiáng)的黏附能力，而生物膜形成能力一般。其中10株菌株擴(kuò)增出icaAD和icaBC基因。結(jié)論尿路感染金黃色葡萄球菌的黏附能力和生物膜形成能力具有菌株差異性，ica是金黃色葡萄球菌生物膜形成的重要基因。

金黃色葡萄球菌；尿路感染；生物膜；黏附；ica基因

金黃色葡萄球菌是尿路感染的主要致病菌之一[1-2]，又因其具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，是導(dǎo)管相關(guān)感染的常見病原菌。95%的醫(yī)院尿路感染與尿管使用相關(guān)，隨著尿管使用的增加，尿路感染的金黃色葡萄球菌比例也隨著增加[3]。細(xì)菌形成生物膜后將高度耐藥，其臨床治療也更加困難[4-5]。而尿路分離金黃色葡萄球菌的研究卻少有報(bào)道，因此本研究擬以臨床尿路分離的金黃色葡萄球菌為研究對象，分析其耐藥和生物膜形成能力等特征，以期為臨床感染的診斷及治療提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來源11株金黃色葡萄球菌臨床株(S1301-S1311)分離自2013年1月至2013年6月第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院臨床送檢的尿液標(biāo)本，剔除同一患者的重復(fù)菌株。金黃色葡萄球菌生物膜形成標(biāo)準(zhǔn)菌株N315和質(zhì)控菌株ATCC29213由第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部保存。

1.2儀器與試劑MH培養(yǎng)基(北京陸橋生物技術(shù)有限公司)、胰蛋白胨和酵母提取物(英國Oxoid公司)、DNA提取純化試劑盒(北京Promega公司)、2×Es Taq MasterMix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)、引物(美國Invitrogen公司)、瓊脂糖(北京天根生化科技有限公司)。多點(diǎn)接種儀(日本佐久間公司)，酶標(biāo)儀(美國MD公司)，PCR擴(kuò)增儀、電泳儀和凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的檢測金黃色葡萄球菌劃線接種于血瓊脂平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于10 mL胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)過夜。用無菌生理鹽水稀釋菌液至0.5麥?zhǔn)蠁挝?約108CFU/mL)，再按1∶10的比例稀釋。用多點(diǎn)接種儀將1～2 μL菌液接種到含不同濃度抗菌藥物的MH瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。細(xì)菌MIC值為能抑制細(xì)菌生長的最低藥物濃度，結(jié)果參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)2012年標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行。

1.3.2金黃色葡萄球菌黏附能力的檢測金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物用TSB肉湯以1∶1 000比例稀釋，然后在激光共聚焦顯微鏡(CLSM)專用細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入1 mL菌液和1 mL TSB培養(yǎng)基。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)3 h后，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗去除浮游菌。然后加入PBS緩沖液超聲10 min，以使黏附的細(xì)胞脫落。最后以不同比例稀釋細(xì)胞懸浮液，并涂布于TSB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)。

表1　抗菌藥物對金黃色葡萄菌的MIC值(μg/mL)

1.3.3金黃色葡萄球菌生物膜形成能力的檢測生物膜形成能力分析采用96孔板結(jié)晶紫染色法[7]。金黃色葡萄球菌過夜培養(yǎng)物用TSB肉湯稀釋1 000倍，然后在96孔板中每孔加100 μL稀釋菌液和100 μL TSB肉湯。每個樣品設(shè)置3個復(fù)孔，37 ℃培養(yǎng)24 h。用PBS輕柔沖洗兩次，放置通風(fēng)陰涼處干燥。然后加入200 μL 1%結(jié)晶紫溶液進(jìn)行染色，并以自來水沖洗至空白對照孔無明顯顏色，再次倒置晾干。最后每孔加入100 μL 30%乙酸，并測定590 nm處的吸光度(A590)值。

1.3.4金黃色葡萄球菌生物膜多糖編碼基因的檢測金黃色葡萄球菌DNA提取按照基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。生物膜形成相關(guān)基因引物icaAD-F：5′-CCT AAC TAA CGA AAG GTA GG-3′；icaAD-R：5′-TTA GCG TTG GGT ATT CCC TC-3′。icaBC-F：5′-ATG GTC AAG CCC AGA CAG AG-3′；icaBC-R：5′-GCA CGT AAA TAT ACG AGT TC-3′。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Es Taq MasterMix 10.0 μL，上、下游引物各0.3 μL，DNA 0.4 μL，雙蒸水(ddH2O) 9.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)完畢，PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠電泳30 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用WHONET5.3軟件對藥敏結(jié)果進(jìn)行分析。

2　結(jié)　果

2.1金黃色葡萄球菌的MIC值常見抗菌藥物對金黃色葡萄球菌的MIC結(jié)果，見表1。金黃色葡萄球菌對青霉素和紅霉素耐藥率較高，對慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和利福平具有較高的敏感性。所有菌株均對萬古霉素和呋喃妥因敏感。

2.2金黃色葡萄球菌的黏附能力金黃色葡萄球菌的黏附能力檢測結(jié)果，見圖1。11株臨床菌株都具有較強(qiáng)的黏附能力，除S1303和S1307之外，其他9株的黏附能力都高于標(biāo)準(zhǔn)株N315。

圖1　金黃色葡萄球菌黏附細(xì)胞數(shù)檢測結(jié)果

2.3金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力，見圖2。金黃色葡萄球菌臨床株的生物膜形成能力一般，其中4株菌株(S1302、S1306、S1308、S1311)的生物膜形成能力高于標(biāo)準(zhǔn)株N315。

圖2　金黃色葡萄球菌生物膜形成能力檢測結(jié)果

2.4金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增金黃色葡萄球菌生物膜形成相關(guān)基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，有10株臨床菌株攜帶ica基因，僅有1株擴(kuò)增陰性。

3　討　論

臨床分離的金黃色葡萄球菌對青霉素和紅霉素高度耐藥，對慶大霉素、環(huán)丙沙星、四環(huán)素和利福平具有較高的敏感性，這與相關(guān)研究報(bào)道一致[8-9]。本研究未發(fā)現(xiàn)對萬古霉素和呋喃妥因耐藥的菌株，表明這類藥物可以用于治療金黃色葡萄球菌引起的尿路感染。萬古霉素是抗金黃色葡萄球菌尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的有效抗菌藥物,但異質(zhì)性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌的存在給臨床治療帶來新的挑戰(zhàn)[10]，因此應(yīng)慎重使用該類抗菌藥物，以延緩和減少耐藥菌株的產(chǎn)生。呋喃妥因有穩(wěn)定的抗菌活性，但有30%～50%以原形從尿中排出，腸道吸收量少，因此目前僅用于下尿路感染性疾病的預(yù)防和治療。

金黃色葡萄球菌是生物膜感染的常見致病菌[11]，形成生物膜后細(xì)菌具有高度的耐藥性，并在合適的條件釋放游離細(xì)菌，使感染遷延反復(fù)[12]。研究顯示，尿路分離的金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附能力，只有2株菌株的黏附能力弱于N315，但是只有4株金黃色葡萄球菌的生物膜形成能力強(qiáng)于N315。結(jié)果提示，尿路感染的金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附能力，而生物膜形成能力一般。由于尿路感染金黃色葡萄球菌需要黏附于管腔壁抵抗外力作用才能造成感染，所以必須有較強(qiáng)的黏附能力才能定植。雖然細(xì)菌黏附和生物膜形成是細(xì)菌生物膜形成的兩個階段，但是結(jié)果顯示細(xì)菌的黏附能力和生物膜形成能力并無必然聯(lián)系，提示細(xì)菌生物膜形成調(diào)控過程復(fù)雜。

生物膜的最主要成分是多糖，細(xì)菌的聚集及生物膜成熟階段主要是依靠促進(jìn)細(xì)菌相互聚集的多糖黏附素(PIA)，PIA 主要由ica基因編碼的酶合成，在生物膜形成過程中具有重要作用[13]。本研究僅1株金黃色葡萄球菌的ica陰性，且其生物膜形成能力弱于N315，說明雖然細(xì)菌有不依賴于ica的生物膜形成路徑[14]，但是ica對生物膜形成能力的影響可能還是最重要的。本研究說明尿路感染的金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的黏附能力，提示黏附能力是尿路感染細(xì)菌致病能力的一個重要影響因素。

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Analysis of biofilm formation ability and related genes of Staphylococcus aureus isolated from urinary tract infections*

SunFengjun1，HongHai2，F(xiàn)engWei1，SunYixuan1，XiaPeiyuan1△

(1.DepartmentofPharmacy,SouthwestHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2.ClinicofZhengchangzhuangSanatoriumforRetiredCadres,LogisticsDepartmentofPLA,Beijing100141,China)

ObjectiveTo study the biofilm formation ability and related gene distribution of Staphylococcus(S.) aureus isolated from urinary tract infections to provide the theoretical basis for the prevention and treatment of clinical infection.MethodsThe minimal inhibitory concentration was detected using the agar double dilution method.The bacterial adhesion ability was determined by flat colony counting method.The biofilm formation ability was analyzed by the 96-well crystal violet staining method.The biofilm-associated genes were detected by PCR amplification.ResultsEleven clinical strains of S.aureus were high resistant to penicillin and erythromycin,whereas were all sensitive to vancomycin and nitrofurantoin.All the isolates had a strong ability of adhesion,but the biofilm formation ability was weak.Among them,the icaAD and icaBC genes were amplified in 10 S.aureus isolates.ConclusionThe adhesion ability and biofilm formation ability of S.aureus isolated from urinary tract infections have the strain differences,and ica is an important gene of S.aureus biofilm formation.

Staphylococcus aureus;urinary tract infections;biofilm;adhesion;ica gene

論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.008

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81373451)。作者簡介：孫鳳軍(1979-)，主管藥師，博士，主要從事細(xì)菌耐藥及致病機(jī)制研究?！?/p>

，E-mail:peiyuan_xia2013@163.com。

R378

A

1671-8348(2016)19-2617-03

2016-01-20

2016-03-28)