吳　偉,黃美健

(安徽醫(yī)科大學杭州臨床學院/杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，杭州 310009)

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谷氨酰胺對慢性阻塞性肺疾病患者PBMC中p38MAPK及IL-8的影響*

吳偉,黃美健△

(安徽醫(yī)科大學杭州臨床學院/杭州市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，杭州 310009)

目的探討谷氨酰胺(Gln)對慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血單個核細胞(PBMC)中p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)活性和白細胞介素-8(IL-8)表達的影響。方法選擇32例COPD急性加重期(AECOPD)患者為研究對象，設為AECOPD組，將治療后轉為COPD穩(wěn)定期(SCOPD)的上述患者設為SCOPD組，收集各組PBMC，分別以Gln進行干預，另選擇同期16例健康者為健康對照組。實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測5組PBMC中p38MAPK、IL-8的表達水平。結果(1)AECOPD和SCOPD的空白對照組中p38MAPK、IL-8的表達均高于健康對照組(分別P<0.01，P<0.05),且急性期高于穩(wěn)定期(P<0.05)。(2)AECOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達低于AECOPD空白對照組(P<0.01)；SCOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達低于SCOPD空白對照組(P<0.05)。結論Gln可抑制COPD患者炎性細胞中p38MAPK通路的活化，并下調IL-8的表達。

肺疾病，慢性阻塞性；谷氨酰胺；p38絲裂原活化蛋白激酶；白細胞介素-8

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續(xù)氣流受限為特征的肺部疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率都很高，據(jù)世界衛(wèi)生組織公布，2020年COPD將位居全球死亡原因的第3位[1]。COPD急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD)和并發(fā)癥嚴重影響患者整體疾病的嚴重程度，給患者帶來沉重的經(jīng)濟和精神負擔。越來越多的研究表明，肺部炎性反應的發(fā)生、發(fā)展過程與炎性細胞活性密切相關[2]，因此有效抑制或阻斷炎性細胞及促炎因子的活化環(huán)節(jié)以防治COPD，是國內(nèi)外學者研究的熱點。谷氨酰胺(glutamine，Gln)是人體應激狀態(tài)下的一種條件必需氨基酸，既往大多研究集中在其對營養(yǎng)不良患者的營養(yǎng)免疫調節(jié)及抗氧化作用，關于其對COPD患者抗炎作用的研究很少，特別是其能否通過抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)通路的活化，降低白細胞介素(interleukin，IL)-8水平，筆者尚未見相關報道。本研究通過應用Gln干預AECOPD和COPD穩(wěn)定期(stable chronic obstructive pulmonary disease，SCOPD)患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，觀察其對PBMC中p38MAPK、IL-8基因表達水平的影響，探討Gln在COPD治療中的抗炎作用機制，為臨床應用Gln治療COPD提供新的理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料2014年5月至2015年4月本院呼吸內(nèi)科確診為AECOPD的住院患者32例，其中男17例，女15例；年齡56～78歲，平均(73.2±6.7)歲；所有COPD患者平均病程(28±8)年。上述32例患者經(jīng)常規(guī)治療10～20 d,病情穩(wěn)定進入緩解期后設為SCOPD組。納入標準：(1)符合中華醫(yī)學會呼吸病分會制訂的《慢性阻塞性肺疾病診治指南(2013修訂版)》[3]的診斷標準；(2)近半個月內(nèi)未接受過糖皮質激素治療(包括口服、靜脈或吸入劑等)；(3)未高流量吸氧(吸氧濃度≤35%)及未行機械通氣；(4)不吸煙或已戒煙5年以上。排除標準：(1)患有嚴重心腦血管系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、內(nèi)分泌血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤或經(jīng)歷重大手術等；(2)合并可致咳嗽、咳痰、氣短等癥狀的其他疾病，如肺結核、支氣管擴張、彌漫性泛細支氣管炎、閉塞性細支氣管炎等。另選本院同期體檢健康者16例為健康對照組，其中男9例，女7例；年齡53～77歲，平均(67.4±7.3)歲。入選的COPD患者和健康對照組比較，性別、年齡差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準，納入的所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑Gln(美國Gibco公司，批號：1353655)；人淋巴細胞分離液(美國Sigma公司，批號：108K2031)；反轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司，批號：D2640A-CK101D]；定量試劑盒Power SYBR?Green PCR Master Mix(Applied Biosystems，美國應用生物系統(tǒng)中國公司，批號：4367659)；CFX384多重實時熒光定量PCR儀、電泳系統(tǒng)Mini-Proten Tetra System、凝膠成像儀ChemiDoc XRS+ System(美國Bio-RAD公司)；Du-640紫外分光光度儀(美國Beckman公司)。

1.3方法

1.3.1PBMC的提取及分組所有研究對象取清晨空腹肘靜脈血5 mL，置于肝素抗凝管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)將靜脈血充分稀釋。然后將稀釋后的10 mL靜脈血緩慢地加入裝有4 mL淋巴細胞分離液的15 mL離心管中，2 000 r/min離心20 min，離心后管內(nèi)液體分為4層，緩慢地吸取位于第2層的PBMC，轉移至10 mL離心管，加入5倍體積PBS液洗滌、1 000 r/min離心10 min，棄去上清液，重復洗滌1次，底層沉淀為PBMC，0.4%臺盼藍染色，排除無活性的細胞，活細胞所占百分比大于90%可采用。用培養(yǎng)液將上述提取的PBMC濃度調節(jié)至2.0×106/mL，并接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入細胞混勻液1 mL，其中AECOPD組患者平均分成兩組：(1)Gln組：PBMC中加入終濃度為8 mmol/L的Gln；(2)空白對照組：僅用無Gln RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。SCOPD組患者也平均分成兩組：(1)Gln組：PBMC中加入終濃度為8 mmol/L的Gln；(2)空白對照組：僅用無Gln RPMI-1640培養(yǎng)液。健康對照組僅用無Gln RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。所有細胞均在37 ℃ 25% CO2溫箱里培養(yǎng)24 h。

1.3.2p38MAPK及IL-8基因表達的檢測采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法檢測。用Trizol法提取上述培養(yǎng)后細胞的總RNA，并測定RNA的濃度和純度。用反轉錄試劑盒合成cDNA。PCR引物由上海生物工程有限公司按照引物設計原則采用Primer 5.0和Beacon designer 7.8設計軟件設計合成。其中IL-8引物序列：上游5′-CCA AAC CTT TCC ACC CCA AAT-3′，下游5′-CAC AAC CCT CTG CAC CCA GTT-3′，擴增長度146 bp；p38MAPK引物序列：上游5′-GAC TTG CTG GAG AAG ATG CTT GT-3′，下游5′-GTC CCT GCT TTC AAA GGA CTG AT-3′，擴增長度147 bp；18sRNA內(nèi)參序列：上游5′-GAC TCA ACA CGG GAA ACC TCA C-3′，下游5′-CCA GAC AAA TCG CTC CAC CAA C-3′，擴增長度122 bp。PCR反應條件：95 ℃，1 min；40個循環(huán)：95 ℃，15 s；63 ℃，25 s；熔點曲線分析55～95 ℃。反應體系(20 μL)如下：上游和下游引物各0.5 μL，cDNA模板1.0 μL，Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL，雙蒸水8.0 μL。試驗樣品經(jīng)定量PCR得到各反應孔循環(huán)閾值(Ct值)后運用相對表達量2-△△Ct進行相對定量分析。其中△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值，△Ct值越大說明表達越低。

2　結　果

2.1目的基因及內(nèi)參電泳圖試驗發(fā)現(xiàn)電泳條帶和設計的擴增條帶長度全部符合，擴增條帶為目的條帶，表明擴增的特異性較高，見圖1；具有單一主峰的各個引物擴增產(chǎn)物熔點曲線圖表明引物RT-PCR擴增是特異性的擴增，見圖2。

A：p38MAPK；B：IL-8；C：18s rRNA；M：內(nèi)標；1～6：各目的基因擴增條帶。

圖1目的基因及內(nèi)參電泳圖

A：p38MAPK；B：IL-8；C：18s rRNA。

圖2目的基因及內(nèi)參擴增曲線圖

2.2各組PBMC中p38MAPK及IL-8的△Ct值變化(1)AECOPD和SCOPD的空白對照組中p38MAPK、IL-8的表達均高于健康對照組(分別P<0.01，P<0.05),且急性期高于穩(wěn)定期(P<0.05)。(2)AECOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達低于AECOPD空白對照組(P<0.01)；SCOPD Gln組p38MAPK、IL-8的表達低于SCOPD空白對照組(P<0.05)。見表1。

表1　各組PBMC中p38MAPK及IL-8的△Ct值比較

*：P<0.01，與健康對照組比較；#：P<0.05，與健康對照組比較；△：P<0.01，與AECOPD Gln組比較；▲：P<0.05，與SCOPD Gln組比較。

3　討　論

在COPD的整個病程中，炎癥一直被認為是其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[3]。p38MAPK作為一種MAPK家族中的重要成員，是啟動炎性細胞釋放大量細胞因子，觸發(fā)炎性反應的關鍵，前者可被多種應激刺激、炎性因子等激活，從而影響細胞的轉錄、蛋白合成和細胞表面受體表達等，與細胞凋亡、免疫調節(jié)和炎性反應的調控密切相關[4]。Marumo等[5]報道香煙暴露小鼠肺氣腫的形成與p38MAPK通路的激活有密切關系。Gaffey等[6]研究發(fā)現(xiàn)，COPD患者的肺巨噬細胞及上皮細胞中p38MAPK的表達明顯高于健康者，同時應用其抑制劑可以明顯降低IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α等炎性介質的釋放。IL-8作為趨化因子的一種，參與了中性粒細胞和淋巴細胞的聚集與活化，并且誘導氣道上皮細胞IL-8基因的表達，進而導致IL-8的進一步釋放，由此形成氣道內(nèi)的炎性循環(huán)。Liu等[7]的研究表明，AECOPD患者血清和呼出氣冷凝液中IL-8表達明顯增加。王彥霞等[8]發(fā)現(xiàn)，AECOPD患者PBMC中的IL-8和TNF-α水平高于治療后和對照組，且與第1秒最大呼氣量占預計值百分比(FEV1/Pre%)呈明顯負相關。有學者發(fā)現(xiàn)在香煙誘導的COPD小鼠的PBMC中，IL-6和IL-8的表達是明顯增加的，并且抑制p38MAPK通路可以減少二者的表達[9]。也有研究表明，COPD患者誘導痰中p38MAPK和IL-8表達明顯，p38MAPK的活化與IL-8和中性粒細胞的水平，以及患者肺功能的降低有明顯相關性[10]。由此可見， p38MAPK在COPD發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了重要角色。因此，以p38MAPK通路為靶點，降低促炎因子的表達，是臨床治療COPD的新途徑。

Gln是體內(nèi)含量最多的條件必需氨基酸之一，作為免疫系統(tǒng)的主要能源，具有促進體內(nèi)蛋白質合成、保護胃腸黏膜、參與免疫細胞的能量代謝等作用。正常情況下人體中Gln含量較豐富，但在高代謝條件下機體對其需要量遠大于自身合成能力，導致蛋白質合成減少，對機體的免疫功能產(chǎn)生不利影響。研究發(fā)現(xiàn)，Gln對COPD合并營養(yǎng)不良患者免疫功能有顯著改善作用[11]。研究人員發(fā)現(xiàn)，Gln能抑制敗血癥小鼠p38MAPK通路、核因子κB(NF-κB)通路的激活，且實驗發(fā)現(xiàn)經(jīng)過Gln的治療能明顯降低TNF-α和IL-18等炎性因子的表達水平[12]。Lee等[13 ]發(fā)現(xiàn)小鼠模型氣道內(nèi)中性粒細胞的聚集與p38MAPK及其下游通路絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)通路介導的細胞質磷脂酶A2(CPA2)的活化有關，Gln可通過阻斷該通路來減少炎性細胞的聚集?；诩韧芯抗P者發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)有關Gln的研究僅局限于Gln的抗氧化功能及免疫系統(tǒng)調節(jié)功能，且Gln與p38MAPK通路的激活及細胞因子表達的抗炎機制研究也僅限于動物實驗。因此，筆者前期研究通過應用Gln干預COPD患者的PBMC，觀察其對NF-κB通路和TNF-α的影響，結果表明Gln可抑制NF-κB通路的活化，降低TNF-α的表達[14]。那么Gln是否同樣可抑制COPD患者p38MAPK通路并降低IL-8的表達，進一步起到對COPD的抗炎作用，需要進一步探討。 目前，國內(nèi)外尚未見關于Gln對COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8表達影響的研究報道。因此，筆者在前期研究的基礎上做了進一步研究，探討Gln對COPD患者PBMC中p38MAPK及IL-8表達的影響。

本研究以AECOPD患者PBMC為研究靶點，運用Gln干預其治療前后的PBMC，檢測PBMC中p38MAPK、IL-8的表達變化，結果顯示，p38MAPK、IL-8在COPD患者炎性細胞中表達。AECOPD治療前、后空白對照組較健康對照組表達水平高，且急性加重期高于穩(wěn)定期，這也揭示了p38MAPK、IL-8在COPD整個病程中長期持續(xù)地存在，表明了p38MAPK、IL-8與COPD的發(fā)生、發(fā)展有著極為密切的關系。試驗結果還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Gln干預后的AECOPD組和SCOPD組其p38MAPK、IL-8表達明顯低于未予Gln干預的空白對照組。提示了Gln可抑制COPD患者PBMC中p38MAPK通路的活化，抑制炎性介質IL-8的表達，證實了Gln對COPD有一定的抗炎作用。

綜上所述，本研究結果表明COPD患者PBMC中的p38MAPK、IL-8與COPD炎性反應的發(fā)生、發(fā)展明顯相關；Gln能抑制COPD患者PBMC中p38MAPK通路的活化并降低炎性介質IL-8的表達，從而起到對COPD患者的抗炎作用，為今后臨床應用Gln治療COPD提供新的試驗和理論依據(jù)。然而，由于本試驗樣本量的局限，且僅限于離體細胞水平，在一定程度上影響了研究結果及其精確性。因此，有關Gln抗炎作用更深入的分子機制仍有待今后更大規(guī)模的臨床研究進一步驗證。

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Effect of glutamine on p38MAPK and IL-8 expression in PBMC of patients with chronic obstructive pulmonary disease*

WuWei，HuangMeijian△

(DepartmentofRespiraion,HangzhouClinicalCollegeofAnhuiMedicalUniversity/HangzhouMunicipalThirdPeople′sHospital,Hangzhou,Zhejiang310009,China)

ObjectiveTo investigate the effects of glutamine (Gln) on the p38MAPK activity and IL-8 expression in peripheral blood mononuclear cells(PBMC) of the patients with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).MethodsThirty-two patients with acute exacerbation of COPD (AECOPD ) were chosen as the research subjects(AECOPD group).Then the patients converting to the stable stage of COPD after treatment were set as the SCOPD group.PBMC of each group were extracted and conducted the Gln intervention.At the same time 16 healthy people were selected as the healthy control group.The real-time PCR(RT-PCR) was used to detect the levels of p38MAPK and IL-8 expression in PBMC among the five groups.Results(1)The expressions of p38MAPK and IL-8 in the AECOPD blank control group and the SCOPD blank control group were both higher than those in the healthy control group (P<0.01 orP<0.05),while the expression levels of p38MAPK and IL-8 in patients with AECOPD was higher than those of patients with SCOPD,the difference was statistically significant(P<0.05).(2)The expression levels of p38MAPK and IL-8 in the AECOPD Gln group were lower than those in the AECOPD blank control group (P<0.01);the expression levels of p38MAPK and IL-8 in the SCOPD Gln group were lower than those in the SCOPD blank control group (P<0.05).ConclusionGln could inhibit the p38MAPK pathway activation in inflammatory cells of COPD patients and reduce the expression level of IL-8.

pulmonary disease,chronic obstructive;glutamine;p38 mitogen-activated protein kinase;interleukin-8

·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.19.001

杭州市衛(wèi)生科技計劃項目(2011B009);杭州市醫(yī)療衛(wèi)生科研項目(20120633B05)。

吳偉(1989-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究?！?/p>

，E-mail：hmeijian@163.com。

R563.9

A

1671-8348(2016)19-2593-03

2016-01-14

2016-03-27)