文/張建列 通訊員/黃博純

世界首例iPS克隆豬是這樣誕生的

文/張建列 通訊員/黃博純

世界上首次獲得iPS（誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，induced Pluripotent Stem Cells）克隆豬，為基于iPS進(jìn)行基因修飾大動物的制作打通了技術(shù)瓶頸；首次將鋅指核酸酶介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)應(yīng)用于豬基因修飾，實現(xiàn)了對大動物高效基因打靶；首次將2A序列介導(dǎo)的多基因轉(zhuǎn)移技術(shù)應(yīng)用于豬基因組修飾，成功獲得了四色熒光豬，并實現(xiàn)了多個外源基因在動物體內(nèi)的高效協(xié)同表達(dá)……這些原創(chuàng)成果都出自中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院聯(lián)合南方醫(yī)科大學(xué)、浙江大學(xué)、深圳華大基因研究院等完成的項目“豬基因突變技術(shù)創(chuàng)新及基因修飾豬模型的建立”，該項目組在大動物基因修飾技術(shù)方面所取得的突破及所獲得的動物模型，將進(jìn)一步促進(jìn)基因修飾大動物作為生物醫(yī)藥模型的研究，推動生物醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展，并獲得2015年度廣東省科學(xué)技術(shù)獎一等獎。

作為人類疾病模型豬比小鼠更為理想

人類疾病動物模型作為人類疾病的“復(fù)制品”，可按研究者的需要隨時采集各種樣品或分批處死動物收集標(biāo)本，以了解疾病全過程，這是臨床難以辦到的。項目的第二完成人、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院副研究員樊娜娜介紹，人類疾病的動物模型是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動物，包括小鼠、豬、狗等，主要用于實驗生理學(xué)、實驗病理學(xué)和實驗治療學(xué)（包括新藥篩選）研究?！芭c人類完全相同的動物自發(fā)性疾病模型畢竟不可多得，往往需要人工加以復(fù)制。為了盡量做到與人類疾病相似，首先要注意動物的選擇?！?/p>

從基因角度上看，豬與人類基因的相似性達(dá)到83%，因此豬在醫(yī)學(xué)研究上有很大前景。樊娜娜說，小鼠與人在心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、營養(yǎng)代謝等方面與人體差異較大，用做人類疾病模型時不能準(zhǔn)確反映人類疾?。恍∈篌w型小、壽命短不適合進(jìn)行一些治療技術(shù)開發(fā)和長效研究?！氨热纾驗樨i與人類生理比較接近，我們可以讓豬得人類的疾病，進(jìn)而探討治療方法，這比將小鼠作為模型動物要可靠得多。

“小鼠研究模型有很多種，也很成熟，但和人的差異比較大，不能完全反映人的情況。炎癥反應(yīng)小鼠和人是不同的，前幾年美國曾經(jīng)上市一種治療糖尿病的藥品，在小鼠實驗的效果非常理想，然而用到人身上卻副作用非常大，最終這個藥被撤了。現(xiàn)在美國FDA審批藥物上臨床治療時，要求有大動物模型實驗后，才能用到人上?！?/p>

人源化胰島素基因編輯豬

打通技術(shù)壁壘獲得世界首例iPS克隆豬

豬的生理特征、器官組織結(jié)構(gòu)和人類比較類似，特別是豬的肝臟、心臟等器官與人類的相似性也很高，科學(xué)家們一直在尋找將豬作為人源化器官培養(yǎng)體的方式。樊娜娜說，這一切都需要制備基因修飾豬。自2007年起，在項目的第一完成人、中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員賴良學(xué)的帶領(lǐng)下，項目組聚焦大動物基因修飾技術(shù)研究及基因修飾動物模型的建立工作。

樊娜娜介紹：“目前來說轉(zhuǎn)基因豬制備包括隨機(jī)轉(zhuǎn)基因和基因打靶兩種方式，其中：隨機(jī)轉(zhuǎn)基因豬是把外源基因放到豬里面，讓豬表達(dá)它自己沒有的基因；基因打靶是把某個基因放到豬基因的特定位置，想對豬的哪個基因進(jìn)行突變或修飾都可以?；虼虬邪▋煞N功能：一是基因敲除，即把某個基因去掉，二是基因敲入，是把某個基因放到基因組的某一個地方?！?/p>

但是，由于缺乏豬胚胎干細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因豬的制備主要依賴于體細(xì)胞基因修飾和體細(xì)胞核移植技術(shù)。這種技術(shù)用來進(jìn)行隨機(jī)轉(zhuǎn)基因豬的制作無壓力，但是由于體細(xì)胞打靶效率極低，對豬進(jìn)行基因定點修飾非常困難。這成了研究中最大的瓶頸。各國科學(xué)家都希望通過豬的iPS來克隆豬，但未能獲成功?！癷PS的出現(xiàn)為大動物基因打靶提供了新的希望。獲得基因打靶的iPS細(xì)胞之后，一方面可以通過嵌合體技術(shù)，獲得生殖系嵌合的動物，經(jīng)過交配獲得基因修飾動物；另一方面，可將這些基因打靶iPS細(xì)胞為核供體，通過核移植技術(shù)獲得基因修飾克隆動物?！?/p>

在不懈努力下，項目組發(fā)現(xiàn)外源基因的表達(dá)和表觀遺傳學(xué)可能是影響iPS克隆胚胎發(fā)育的主要原因，經(jīng)過反復(fù)的實驗，項目組在2011年獲得世界上第一個成活的iPS克隆豬。iPS來源克隆豬的成功，為基于iPS 進(jìn)行基因修飾豬的制作提供了技術(shù)路線，克服了以體細(xì)胞進(jìn)行基因修飾存在的體外增殖能力有限，打靶效率低的難題。

研究團(tuán)隊在iPS克隆豬剖腹產(chǎn)后的合影

大動物基因打靶領(lǐng)域項目組技術(shù)國際領(lǐng)先

如何提升豬的打靶效率？樊娜娜表示，“以前大動物上沒有胚胎干細(xì)胞（ES），體細(xì)胞打靶效率極低，在小鼠上能做的東西大動物上做不到，或者說能做但很難做，所以我們做不過嚙齒類動物。但是近十年，隨著鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)、TALENs基因敲除技術(shù)、CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)等興起，這幾種新的基因打靶技術(shù)的出現(xiàn)使大動物的基因定向修飾變得非常容易，通過這幾種技術(shù)現(xiàn)在我們可以在大動物上實現(xiàn)基因打靶了?！?/p>

2008年，鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)被開發(fā)出來，“當(dāng)時我們項目組立即跟進(jìn)，將該技術(shù)應(yīng)用于豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行基因打靶，確立了以鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)對胎兒成纖維進(jìn)行打靶后再進(jìn)行核移植的高效基因打靶豬制作技術(shù)路線?！狈饶忍寡裕@獎項目只是針對鋅指核酸酶基因打靶技術(shù)的應(yīng)用，但是項目組一直沒有停步，一直緊跟基因打靶技術(shù)的前沿，在TALENs基因敲除技術(shù)和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)等當(dāng)前先進(jìn)基因修飾技術(shù)在大動物基因修飾應(yīng)用領(lǐng)域，項目組也處于國際的領(lǐng)先水平。

“目前來說，國內(nèi)外在轉(zhuǎn)基因、基因打靶方面技術(shù)基本上與國際是同步的，但這些技術(shù)都不是我們國內(nèi)科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的，而把這些技術(shù)應(yīng)用到大動物領(lǐng)域并取得重大研究成果，我們是占據(jù)了領(lǐng)先位置。”

人類疾病模型豬“身嬌肉貴”應(yīng)用還需努力推廣

據(jù)悉，通過實施該項目，項目組在《Cell Research》、《Human Molecular Genetics》等雜志上發(fā)表論文5篇，其中發(fā)表在《Human Molecular Genetics》的論文被選為封面文章刊出。論文被SCI數(shù)據(jù)庫論文總引用149次，他引115次，單篇最高引用49次，他引42次。項目在大動物基因修飾技術(shù)方面所取得的突破及所獲得的動物模型將進(jìn)一步促進(jìn)基因修飾大動物作為生物醫(yī)藥模型的研究，推動生物醫(yī)藥業(yè)的發(fā)展，具有巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。

“目前，我們建立了多種人類疾病模型豬、器官移植模型豬、基礎(chǔ)研究工具豬模型等。其中，我們建立的人類亨廷頓疾病模型豬表現(xiàn)出與人類亨廷頓舞蹈癥患者腦中類似的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，這在亨廷頓疾病模型中是首次見到?！狈饶冉馕稣f，亨廷頓疾病是遺傳性神經(jīng)退行性疾病，影響肌肉的協(xié)調(diào)性，導(dǎo)致認(rèn)知功能減退和精神問題。豬的大腦結(jié)構(gòu)與人更為接近，適合用于人退行性神經(jīng)疾病的研究?！昂嗤㈩D疾病模型豬已列入亨廷頓疾病協(xié)作組，對全世界亨廷頓疾病研究團(tuán)隊開放使用，以促進(jìn)亨廷頓疾病治療研究，這一項目的完成推動了我國大動物模型研究工作，促進(jìn)了豬這一大動物模型在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究。”

樊娜娜也坦言，這些人類疾病模型豬還處于發(fā)展的初期。目前，這些模型做出來了但是還沒有得到大規(guī)模的應(yīng)用，這里有多方面的原因：一是沒有相應(yīng)的高標(biāo)準(zhǔn)的飼養(yǎng)條件，如無病原飼養(yǎng)室，如免疫缺陷型模型豬對病源無抵抗力，在普通飼養(yǎng)環(huán)境中不能長期存活；另外，對豬行為學(xué)、影像學(xué)的研究缺少完善的評價體系，導(dǎo)致很多模型無法廣泛應(yīng)用，這些評價標(biāo)準(zhǔn)還需要實驗動物行為學(xué)的專業(yè)人員參與制定。

展望：豬器官移植到人體不是夢

豬作為重要的經(jīng)濟(jì)動物是人類生活關(guān)系最為密切的家畜之一，轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛?？梢詫ωi的基因進(jìn)行改造，提高豬肉產(chǎn)量，改善豬肉的質(zhì)量，增加豬肉的營養(yǎng)價值等，也可以提高豬的抗病能力。樊娜娜還舉了一個例子，比如糖尿病人，是不能吃糖的。“但是可以將一種糖味蛋白基因轉(zhuǎn)到牛身上，讓這個基因在乳腺中表達(dá)，那么這種牛產(chǎn)出的奶就是有甜味。這種牛奶的甜味不是來自糖而是來自蛋白，這樣糖尿病人就可以吃到有甜味的牛奶了?！?/p>

豬在解剖、組織、生理和營養(yǎng)代謝等方面均與人類最接近，在生物醫(yī)藥方面，可以進(jìn)行異種器官移植，即把豬的器官移植到人身上，比如把豬的腎臟、心臟、胰臟、角膜等往人身上移。在此之前，賴良學(xué)研究員及其合作者曾經(jīng)將超級性排斥相關(guān)基因敲除后的豬心臟移植到狒狒身上，并成功最終存活了6個月左右。樊娜娜說，豬器官移植到人體，阻礙異種器官移植工作獲得成功的首要問題是免疫學(xué)上的排異反應(yīng)問題，再就是豬的內(nèi)源性病毒?！柏i的內(nèi)源性病毒是整合在豬的基因組內(nèi)的，對豬是沒有影響，但是豬器官移植到人體，病毒可能會被激活，讓人感染得病。目前我們項目組正在把這些病毒基因敲掉?！?/p>

目前干細(xì)胞技術(shù)發(fā)展很快，更大膽的展望是人源化器官的實現(xiàn)，“讓豬體內(nèi)長出人的器官?！狈饶冉忉屨f，將來把人的干細(xì)胞放到器官缺陷豬的早期胚胎中，這樣豬就可以長出人的器官，這就是人源化器官，在此之前有日本科學(xué)家在小鼠身上長出大鼠的胰臟，說明人源化器官的預(yù)想是可實現(xiàn)的，這也是未來大有前途的研究領(lǐng)域。在賴良學(xué)研究員的帶領(lǐng)下，項目組目前已經(jīng)在開展人源化器官的研究工作。