萬(wàn)明勝，張?jiān)?，吳士文?/p>

熱射病后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化①

萬(wàn)明勝1，張?jiān)?，吳士文1，2

目的觀察熱射病后大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)間的變化。方法Sprague-Dawley大鼠分為對(duì)照組（n=5）和熱射病組（n=14），后者又分為7 d、21 d兩個(gè)亞組，每亞組7只。熱射病組建立熱射病模型，于預(yù)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取大鼠腦組織進(jìn)行尼氏染色，計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)存活錐體細(xì)胞。結(jié)果熱射病組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)明顯減少（F=11.80，P＜0.01），其中21 d亞組低于7 d亞組（P＜0.05）。結(jié)論熱射病后海馬組織CA1區(qū)錐體神經(jīng)細(xì)胞隨時(shí)間減少，可能是導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶受損的原因之一。

熱射病；海馬；錐體細(xì)胞；大鼠

［本文著錄格式］萬(wàn)明勝，張?jiān)?，吳士?熱射病后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化［J］.中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2016，22（7）:793-796.

CITED AS:Wan MS，Zhang Y，Wu SW.Variability of pyramidal neurons in hippocampal CA1 area with time after heat stroke in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:793-796.

熱射?。╤eat stroke，HS）是中暑中最為嚴(yán)重的類(lèi)型，是指高熱（核心體溫＞40℃）伴神志障礙。腦是熱射病早期最易受損的器官，尤以小腦和海馬損害為甚。隨著全球氣候逐漸變暖，熱浪天氣頻繁發(fā)生［1］，高溫所致的熱射病給人類(lèi)健康帶來(lái)嚴(yán)重威脅，熱射病對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損害具有很高的致死率和致殘率。

既往已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，熱射病后海馬組織細(xì)胞數(shù)量減少，但缺乏定量研究。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，熱射病后存在學(xué)習(xí)、記憶功能受損［2］。

本文觀察熱射病后不同時(shí)間大鼠海馬組織CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)，探討熱射病后學(xué)習(xí)、記憶能力受損的機(jī)制，并探討可能的評(píng)價(jià)腦組織損傷嚴(yán)重程度的方法。

1材料與方法

1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

戊巴比妥鈉：SIGMA公司。尼氏染色液試劑盒：北京雷根生物技術(shù)有限公司。PowerLab/4SP多通道生理記錄儀：ADInstruments公司。XMZ404電子溫度傳感器、動(dòng)脈壓力傳感器：成都儀器廠。冰凍切片機(jī)：德國(guó)徠卡公司。DP70顯微鏡：OLYMPUS公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠19只，8周齡，體質(zhì)量260～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001。每籠5～6只飼養(yǎng)，環(huán)境溫度（25±0.5）℃，12 h晝夜周期，自由飲食。適應(yīng)環(huán)境5 d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

大鼠分為對(duì)照組（Sham，n=5）和熱射病組（HS，n= 14），其中熱射病組又分為熱射病后7 d組（HS7）和熱射病后21 d組（HS21），均7只。

1.3模型建立

3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉。

Sham組股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓。置于溫度（25± 0.5）℃、濕度25%環(huán)境中。蘇醒后獨(dú)籠飼養(yǎng)在（25± 0.5）℃動(dòng)物房?jī)?nèi)，12 h晝/夜周期，自由飲食。

HS組股動(dòng)脈插管，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓及直腸溫度，置于溫、濕度控制箱中，暴露于（39.5±0.2）℃、濕度13.5%環(huán)境中，約90～120 min，大鼠核心體溫≥42℃或平均動(dòng)脈壓降至50 mmHg后，迅速拔出股動(dòng)脈插管，予4℃涼水沖洗10 min。蘇醒后獨(dú)籠飼養(yǎng)在（25± 0.5）℃動(dòng)物房?jī)?nèi)，12 h晝/夜周期，自由飲食。

1.4病理切片制備

1.4.1取材與切片

各組大鼠于預(yù)定時(shí)間，Sham組于術(shù)后第2天，予3%戊巴比妥鈉1 ml/kg腹腔注射麻醉，固定于鼠板上，灌注用輸液瓶高于操作臺(tái)約1.5 m。大鼠左側(cè)胸骨旁線(xiàn)剪開(kāi)胸腔，暴露心臟和左側(cè)胸腔，從左心室插入灌注針至主動(dòng)脈根部，注意勿損傷室間隔；縫線(xiàn)固定針頭，夾閉胸主動(dòng)脈，剪開(kāi)右心耳，灌入4℃預(yù)冷生理鹽水約100 ml，直至大鼠眼球、雙前肢變白，右心耳流出清亮灌注液體；繼以4℃預(yù)冷4%多聚甲醛灌注固定約100 ml，先快后慢，至大鼠前肢、后頸部肌肉僵硬為止。斷頭，取出全腦，4℃4%多聚甲醛浸泡固定48 h。固定后的腦組織于視交叉與四疊體間切取4 mm腦片，20%、30%梯度蔗糖溶液脫水至沉底。OCT膠包埋，液氮預(yù)冷的異戊烷速凍，置-80℃冰箱中保存。冰凍切片機(jī)切取視神經(jīng)交叉后約3 mm的海馬組織，厚10 μm，貼于黏附載玻片上，室溫風(fēng)干，密閉置-80℃冰箱中保存以備染色。

1.4.2尼氏染色及計(jì)數(shù)

切片滴焦油紫液（試劑A）3～4滴，置濕盒中，56℃溫箱中染色1 h，蒸餾水洗凈染液；分化液（試劑B）中分化1～3 min，顯微鏡下觀察至背景接近無(wú)色或淺藍(lán)色為止；蒸餾水沖洗凈分化液，無(wú)水乙醇迅速脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片。10×40倍光鏡下分別對(duì)每側(cè)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞層選取3個(gè)視野（圖1），每張切片獲取6個(gè)視野，每只大鼠取連續(xù)3張切片，共獲取18個(gè)視野。盲法用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量每張圖片中錐體細(xì)胞條帶長(zhǎng)度，人工計(jì)數(shù)細(xì)胞膜、核膜完整，核仁清楚的存活錐體細(xì)胞數(shù)，換算成錐體細(xì)胞數(shù)/mm，作為切片的計(jì)數(shù)結(jié)果。取3張切片的平均值作為每只標(biāo)本的計(jì)數(shù)結(jié)果。

圖1　CA1區(qū)計(jì)數(shù)框的選取方法（尼氏染色，40×）

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)各組間有非常顯著性差異（P＜0.01）。與Sham組比較，HS7組和HS21組存活錐體細(xì)胞數(shù)目減少（P＜0.05），HS21組低于HS7組（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖2。

表1　　各組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)（/mm）

圖2　各組海馬CA1區(qū)尼氏染色（400×）

3討論

中暑是指在高溫、高濕環(huán)境下，機(jī)體產(chǎn)熱、散熱失衡，體溫調(diào)節(jié)中樞功能障礙，汗腺功能衰竭和水、電解質(zhì)喪失過(guò)多而出現(xiàn)的相關(guān)臨床表現(xiàn)。依據(jù)發(fā)病時(shí)臨床表現(xiàn)的不同，可將中暑分為熱痙攣、熱衰竭和熱射病。

熱射病為中暑最嚴(yán)重的表現(xiàn)。依據(jù)發(fā)病時(shí)的狀態(tài)和發(fā)病機(jī)制，可將熱射病分為非勞力性熱射?。╪onexertional heat stroke）和勞力性熱射?。╡xertional heat stroke）。前者又稱(chēng)經(jīng)典型熱射病，是由于體溫調(diào)節(jié)功能障礙，散熱減少引起，常發(fā)生在炎熱天氣中久坐不動(dòng)的人群，多數(shù)是老年人；后者是由于機(jī)體產(chǎn)熱過(guò)多引起，常見(jiàn)于參加運(yùn)動(dòng)的人群，因此可發(fā)生于非炎熱天氣時(shí)。兩者均具有致命性，病死率20%～70%，50歲以上人群更高達(dá)80%；勞力性熱射病也是運(yùn)動(dòng)員第3位引起死亡的原因［3］。

熱射病的定義是高熱（核心體溫＞40℃）伴神志障礙，中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀尤為突出，可出現(xiàn)譫妄、驚厥、昏迷、共濟(jì)失調(diào)、記憶障礙等，即使經(jīng)及時(shí)降溫等治療而存活的個(gè)體，也有近30%遺留永久性神經(jīng)功能損害［4］；在永久性功能損害的患者中，神經(jīng)功能損害占76%～100%［5-7］。

腦是熱射病早期最易受損的器官。對(duì)熱射病患者死后的尸檢發(fā)現(xiàn)，腦部存在水腫、局灶性出血和點(diǎn)狀梗死［8］；隨著熱打擊程度加重，腦水腫加重，逐漸出現(xiàn)神經(jīng)元變性、壞死等［9-10］，尤以小腦Purkinje細(xì)胞病變較為突出，因此常發(fā)生構(gòu)音障礙、共濟(jì)失調(diào)和辨距不良等小腦癥狀，影像學(xué)檢查也可發(fā)現(xiàn)小腦進(jìn)行性萎縮，灰白質(zhì)界限不清等。

既往的臨床和基礎(chǔ)研究主要聚焦于小腦損害，對(duì)海馬的損害關(guān)注較少。雖然海馬組織對(duì)熱打擊不如小腦敏感［11］，但也存在一定程度損害，臨床上可發(fā)現(xiàn)熱射病患者存在認(rèn)知功能障礙、記憶力減退、注意力不集中等，影像學(xué)也可發(fā)現(xiàn)熱射病后海馬存在異常信號(hào)［12-14］。

海馬是腦參與學(xué)習(xí)、記憶功能最重要的區(qū)域，海馬損傷可引起學(xué)習(xí)、記憶功能受損［15］。在海馬結(jié)構(gòu)中，CA1區(qū)對(duì)缺血等損傷因素具有選擇易感性，而CA3區(qū)及齒狀回相對(duì)穩(wěn)定［16］，因此大部分對(duì)海馬損傷的研究都集中在CA1區(qū)。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)證明，熱射病7 d后，大鼠存在學(xué)習(xí)記憶功能障礙［2］。進(jìn)一步研究顯示，熱射病后21 d，學(xué)習(xí)、記憶能力仍低于正常，遺留有遠(yuǎn)期損害，但程度較7 d時(shí)有所好轉(zhuǎn)［17］。已有研究顯示，高溫可致海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷，主要方式是細(xì)胞凋亡［18］。本研究顯示，熱射病后錐體細(xì)胞數(shù)有所減少，這可能是引起認(rèn)知功能損害的原因之一。研究表明，成年大鼠海馬齒狀回顆粒細(xì)胞終生具有生成新神經(jīng)元的能力，顆粒細(xì)胞下層能產(chǎn)生新的顆粒細(xì)胞，形成新的突觸聯(lián)系，這對(duì)學(xué)習(xí)、記憶功能有至關(guān)重要的作用［19］，這也可解釋熱射病大鼠后期學(xué)習(xí)、記憶能力能夠部分恢復(fù)的現(xiàn)象。

熱射病對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損傷的原因主要來(lái)源于兩個(gè)方面：一是高熱可直接造成細(xì)胞損傷，引起酶變性、線(xiàn)粒體功能障礙、細(xì)胞膜穩(wěn)定性喪失和有氧代謝途徑中斷；二是由內(nèi)毒素血癥、炎癥因子和其他免疫介質(zhì)誘發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征對(duì)組織造成的損傷。已有多項(xiàng)研究也證實(shí)，白細(xì)胞介素-1α、1β，腫瘤壞死因子-α等炎癥因子在熱打擊后顯著升高［20］，這也可以解釋為什么停止熱打擊后，組織損傷仍然繼續(xù)并遺留長(zhǎng)期后遺癥。

腦缺血、缺氧是熱射病主要的病理生理基礎(chǔ)，既往對(duì)熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究多停留在形態(tài)學(xué)觀察，進(jìn)行定量研究的較少，且缺乏敏感及可重復(fù)的對(duì)損傷嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)價(jià)的指標(biāo)。由于健康Sprague-Dawley大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列相對(duì)均一；在遭受諸如缺血等損傷后，即使在同一CA1區(qū)，細(xì)胞密度也不均勻，計(jì)數(shù)位置的選取對(duì)結(jié)果影響較大，損傷急性期尤為明顯。因此計(jì)數(shù)時(shí)不能局限在單個(gè)區(qū)域，應(yīng)分散至多個(gè)區(qū)域或?qū)φ麄€(gè)CA1區(qū)進(jìn)行計(jì)數(shù)［21］。本研究對(duì)每只大鼠腦組織同一冠狀切面進(jìn)行切片，減小了取材導(dǎo)致的個(gè)體間差異。選取7 d和21 d相當(dāng)于熱射病急性后期和恢復(fù)期，并分別于左、右海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取多個(gè)視野，計(jì)數(shù)錐體細(xì)胞及細(xì)胞條帶長(zhǎng)度，減小了細(xì)胞密度不均一對(duì)結(jié)果的影響。這種計(jì)數(shù)辦法或許可以成為一種可行的評(píng)價(jià)熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度的方法，同時(shí)對(duì)于干預(yù)措施效果評(píng)定的研究也有一定的意義。

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Variability of Pyramidal Neurons in Hippocampal CA1Area with Time after Heat Stroke in Rats

WAN Ming-sheng1，ZHANG Yun2，WU Shi-wen1，2
1.The Clinical College of the General Hospital of Chinese People's Armed Police Forces，Anhui Medical University，Beijing 100039，China；2.the General Hospital of Chinese People'sArmed Police Forces，Beijing 100039，China
Correspondence to WU Shi-wen.E-mail:neurowu@gmail.com

Objective To observe the pyramidal neurons in the hippocampal CA1 area varying with time after heat stroke in rats.Methods Sprague-Dawley rats were divided into sham group（n=5）and heat stroke group（n=14），and the heat stroke group was divided into 7-day subgroup and 21-day subgroup（n=7 at each group）after heat stroke.Heat stroke group was established model of heat stroke.The brain tissues of rats were observed with Nissl staining to count the living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area.Results The number of living pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decreased in the heat stroke group（F=11.80，P＜0.01），and decreased more in the 21-day subgroup than in the 7-day subgroup（P＜0.05）.Conclusion Pyramidal neurons in hippocampal CA1 area decrease with time after heat stroke，which may be associated with the learning and memory impairment.

heat stroke；hippocampus；pyramidal neuron；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.011

R594.1

A

1006-9771（2016）07-0793-04

國(guó)家發(fā)改委衛(wèi)星專(zhuān)項(xiàng)基金項(xiàng)目（No.發(fā)改辦高技［2013］2140）。

1.安徽醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院臨床學(xué)院，北京市100039；2.武警總醫(yī)院，北京市100039。作者簡(jiǎn)介：萬(wàn)明勝（1988-），男，漢族，湖南岳陽(yáng)市人，碩士研究生，主要研究方向：熱射病中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的研究。通訊作者：吳士文，男，博士，副教授、碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: neurowu@gmail.com。

2016-02-03

2016-03-04）