孟慶峰，張明超，盧偉，畢云龍，范仲凱

乙酰左旋肉堿對急性脊髓損傷大鼠細(xì)胞自噬、凋亡及運(yùn)動功能的影響①

孟慶峰1，2，張明超1，盧偉1，畢云龍1，范仲凱1

目的旨在檢測乙酰左旋肉堿（ALC）對大鼠急性脊髓損傷（SCI）后微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）-Ⅱ、細(xì)胞凋亡及運(yùn)動功能的影響。方法成年雌性Sprague-Dawley大鼠36只隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、單純脊髓損傷組（SCI組）、ALC治療組，每組12只。Allen法建立大鼠T10脊髓損傷模型。損傷后3 d行BBB運(yùn)動評分；取脊髓組織，Western blotting和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測LC3-Ⅱ表達(dá)，TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡。結(jié)果與Sham組相比，SCI組LC3-Ⅱ明顯升高（P＜0.01），細(xì)胞凋亡顯著增加（P＜0.001），BBB評分顯著降低（P＜0.001）；與SCI組相比，ALC組LC3-Ⅱ顯著升高（P＜0.001），細(xì)胞凋亡顯著降低（P＜0.001），BBB評分明顯提高（P＜0.01）。結(jié)論ALC可能通過增強(qiáng)大鼠脊髓損傷后細(xì)胞自噬，減少細(xì)胞凋亡，促進(jìn)大鼠運(yùn)動功能恢復(fù)。

急性脊髓損傷；乙酰左旋肉堿；自噬；凋亡；大鼠

［本文著錄格式］孟慶峰，張明超，盧偉，等.乙酰左旋肉堿對急性脊髓損傷大鼠細(xì)胞自噬、凋亡及運(yùn)動功能的影響［J］.中國康復(fù)理論與實踐，2016，22（7）:754-758.

CITED AS:Meng QF，Zhang MC，Lu W，et al.Effects of acetyl-l-carnitine on autophagy，apoptosis，and locomotor function after acute spinal cord injury in rats［J］.Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian，2016，22（7）:754-758.

急性脊髓損傷（acute spinal cord injury，ASCI）是一個全球性醫(yī)學(xué)難題，嚴(yán)重危害人類健康。脊髓損傷是一個復(fù)雜的病理生理過程，近年來研究表明，細(xì)胞自噬作為全身應(yīng)激反應(yīng)的重要組成部分［1］，在脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元中明顯增強(qiáng)［2］，對脊髓損傷的發(fā)生發(fā)展起著重要作用［3-4］。細(xì)胞自噬是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)并再循環(huán)利用的過程，在細(xì)胞的存活、分化及穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，是真核細(xì)胞特有的生命現(xiàn)象［5］。乙酰左旋肉堿（acetyl-L-carnitine，ALC）可以通過血腦屏障［6］，能促進(jìn)脂肪酸進(jìn)入線粒體，在能量代謝中發(fā)揮著重要作用。有研究證實ALC在脊髓損傷中保護(hù)運(yùn)動神經(jīng)元［7-9］。本研究檢測ALC對大鼠ASCI后細(xì)胞自噬及凋亡的影響，旨在探究ALC對大鼠ASCI保護(hù)作用的機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要材料與儀器

ALC：SIGMA-ALDRICH。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（light chain 3，LC3）-Ⅱ抗體2775S：CELL SIGNALING TECHNOLOGY公司。鼠來源β-Actin（C4）sc-47778、山羊抗小鼠IgG-HRP sc-2005、山羊抗兔IgG-HRP sc-2004：SANTA CRUZ公司。IFKine Red AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG（H+L）A24421：ABBKINE公 司 。 NormalDonkeySerum017-000-121：JACKSON IMMUNORESEARCH公司。增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒WBKLS0100、PVDF膜：MILLIPORE公司。In Situ Cell Death Detection Kit，TMR red 12156792910：ROCHE。OCT 4583：美國櫻花SAKURA公司。電泳儀、全自動酶標(biāo)儀：BIO-RAD公 司 。 Dounce勻 漿 器 ： WHEATEN。-80℃超低溫冰箱：THERMO公司。高速冷凍離心機(jī)：EPPENDORF公司。BT100-1L蠕動泵：保定蘭格恒流泵有限公司。冰凍切片機(jī)、熒光顯微鏡DMI4000B：LEICA公司。

1.2實驗動物與分組

健康雌性Sprague-Dawley大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，由遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、單純脊髓損傷組（SCI組）、ALC治療組（ALC組），每組12只。Sham組只暴露T10節(jié)段脊髓，不打擊。SCI組、ALC組采用Allen方法制備ASCI模型［10］。SCI組和ALC組在脊髓打擊后15 min分別腹腔注射生理鹽水或ALC 300 mg/kg［9］。各組大鼠均分為兩個亞組，每個亞組6只，于損傷后3 d，一亞組檢測大鼠Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）運(yùn)動評分［11］和Western blotting法檢測LC3-Ⅱ，另一亞組免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測LC3-Ⅱ和TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.3模型制備

大鼠戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定于手術(shù)臺上，定位T10棘突位置。背部正中剃毛，暴露皮膚，常規(guī)消毒，鋪無菌洞巾，切開皮膚；刀柄分離棘突兩側(cè)肌肉，暴露棘突及椎弓板；咬骨鉗咬除棘突及椎板，暴露T10節(jié)段脊髓，保證硬脊膜完整。采用Allen打擊器［10］，能量20 g×2.5 cm，出現(xiàn)脊髓充血、雙下肢痙攣抖動、尾巴痙攣性擺動，視為造模成功。逐層縫合肌肉和皮膚。

1.4BBB評分

造模后3 d，將動物置于寬闊活動場地自由活動5 min，觀察其后肢運(yùn)動情況，左右兩側(cè)分別評分，取平均值。由不參與動物分組與治療但熟悉評分標(biāo)準(zhǔn)的2位觀察者同時獨立評分，取平均值。

1.5Western blotting

BBB評分后，大鼠戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，快速取脊髓節(jié)段T9-11，生理鹽水沖洗干凈。BCA法測蛋白濃度，10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜；1%BSA室溫封閉1 h，分別加LC3-Ⅱ一抗（1∶1000）、β-Actin一抗（1∶1000）4℃孵育過夜；TBST充分洗膜；山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG二抗（1∶2000）室溫孵育2 h；TBST充分洗膜；增強(qiáng)型ECL化學(xué)液發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)曝光。用Image J軟件分析LC3-Ⅱ和β-Actin的灰度值，計算其比值。

1.6免疫熒光標(biāo)記檢測

造模后3 d，大鼠4%多聚甲醛灌流固定，取T9-11節(jié)段，30%蔗糖脫水2 d。每段脊髓組織取打擊點為中心4 mm，冷凍切片機(jī)中包埋后連續(xù)橫行切片，厚5 μm。加正常驢血清封閉1 h，滴加LC3-Ⅱ一抗（1∶500），4℃孵育過夜。加入熒光二抗標(biāo)記的驢抗兔IgG（1∶500），4℃孵育過夜。DAPI染色2 min，洗片，甘油封片。避光條件下于熒光顯微鏡下觀察。每段脊髓組織取6張切片，在40×10倍視野下隨機(jī)選不重疊的6個視野，計數(shù)LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

1.7熒光TUNEL檢測

冰凍切片方法同上。組織切片按照熒光TUNEL試劑盒操作，熒光顯微鏡下觀察。每張切片在40×10倍視野下隨機(jī)選取打擊周邊區(qū)不重疊的6個視野，計數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)（胞核呈紅色）和細(xì)胞總數(shù)（胞核呈藍(lán)色），計算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)均以（±s）表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.01。

2結(jié)果

2.1Western blotting

與Sham組相比，SCI組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001）；與SCI組相比，ALC組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。見圖1、表1。

圖1　各組大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)

2.2LC3-Ⅱ免疫熒光

各組脊髓切片內(nèi)均可見LC3-Ⅱ陽性表達(dá)。與Sham組相比，SCI組LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞比升高（P＜0.01）；與SCI組相比，ALC組LC3-Ⅱ陽性細(xì)胞比顯著升高（P＜0.001）。見圖2、表1。

圖2　　各組大鼠LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，400×）

2.3TUNEL免疫熒光

各組脊髓切片內(nèi)均可見凋亡細(xì)胞。與Sham組相比，SCI組凋亡細(xì)胞比顯著增多（P＜0.001）；與SCI組相比，ALC組凋亡細(xì)胞比顯著降低（P＜0.001）。見圖3、表1。

2.4BBB評分

損傷前，各組大鼠BBB評分均為21.00分。與Sham組相比，SCI組BBB評分顯著降低（P＜0.001）；與SCI組相比，ALC組BBB評分明顯升高（P＜0.01）。

圖3　　各組大鼠細(xì)胞凋亡情況（TUNEL染色，400×）

表1　各組LC3-Ⅱ表達(dá)、細(xì)胞凋亡及BBB評分比較

3討論

細(xì)胞自噬將細(xì)胞內(nèi)無用的長壽命蛋白質(zhì)、細(xì)胞器等運(yùn)送至溶酶體，降解成有生物活性的小分子，并重新利用，從而維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定［5］。正常情況下，細(xì)胞自噬低水平表達(dá)；而當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化或受到外界各種刺激時，自噬水平上調(diào)。細(xì)胞通過此過程清除胞內(nèi)有害或過剩的細(xì)胞器以及異物，同時提高細(xì)胞對低氧、能量短缺的耐受力，對細(xì)胞起一定的保護(hù)作用［12］。

近來許多研究證實自噬在神經(jīng)系統(tǒng)損傷短期內(nèi)的神經(jīng)保護(hù)作用。Zhang等發(fā)現(xiàn)，腦外傷后細(xì)胞自噬被激活，在急慢性期均發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞損傷與修復(fù)的作用［13］。Erlich等研究顯示，腦損傷后，增強(qiáng)自噬可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡及退行性病變［14］。Sekiguchi等發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)自噬可以明顯減輕大鼠脊髓損傷后神經(jīng)組織損傷，顯著恢復(fù)神經(jīng)功能［15］。

自噬體膜上標(biāo)志性蛋白質(zhì)包括LC3、Atg12與Atg5復(fù)合體等，其中LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ蛋白是由哺乳動物中酵母Atg8基因的同源物編碼的蛋白，參與細(xì)胞自噬過程中自噬體的形成。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成LC3-Ⅱ，進(jìn)而定位于自噬體膜上，其含量多少與自噬體數(shù)目成正比，因此LC3-Ⅰ/Ⅱ是目前公認(rèn)檢測細(xì)胞自噬的最重要標(biāo)志蛋白，是觀察細(xì)胞自噬現(xiàn)象、研究自噬活性最可靠的指標(biāo)［3，16］。本研究顯示，大鼠脊髓損傷后3 d，LC3-Ⅱ表達(dá)明顯增高，表明脊髓組織內(nèi)細(xì)胞自噬被激活，支持Yu等的研究［17］。

ALC是線粒體內(nèi)膜的組成部分，包含乙?；妥笮鈮A兩部分。左旋肉堿在人的大腦、肝臟和腎臟中合成［18］。ALC可以穿過血-腦屏障［19］，并在大腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［20-21］。最近研究發(fā)現(xiàn)，ALC在脊髓損傷中明顯發(fā)揮著神經(jīng)保護(hù)作用［8-9］，但保護(hù)機(jī)制尚不明確。本研究顯示，ALC可提高大鼠脊髓損傷后細(xì)胞自噬水平，也明顯抑制細(xì)胞凋亡。支持Levine等的研究［12］。結(jié)合BBB評分，ALC可能通過促進(jìn)大鼠急性脊髓損傷后細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕神經(jīng)損傷，促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)。

綜上所述，ALC可能通過促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)運(yùn)動功能恢復(fù)。這為脊髓損傷的臨床藥物靶點治療提供了重要的線索，給脊髓損傷患者帶來了希望。干預(yù)細(xì)胞自噬可能成為未來治療脊髓損傷的新方法。

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Effects of Acetyl-l-carnitine on Autophagy，Apoptosis，and Locomotor Function afterAcute Spinal Cord Injury in Rats

MENG Qing-feng1，2，ZHANG Ming-chao1，LU Wei1，BI Yun-long1，F(xiàn)AN Zhong-kai1
1.Department of Orthopedics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Liaoning Medical College，Jinzhou，Liaoning 121001，China；2.Department of Orthopedics，F(xiàn)ushun Central Hospital，F(xiàn)ushun，Liaoning 113006，China
Correspondence to FAN Zhong-kai.E-mail:fanzk_ln@163.com

Objective To observe the effects of acetyl-l-carnitine（ALC）on autophagy，apoptosis and motor function after acute spinal cord injury（ASCI）in rats.Methods Thirty-six adult female Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group（Sham group，n=12），simple spinal cord injury group（SCI group，n=12），ALC treatment group（ALC group，n=12）.Spinal cord injury model at the level of T10segment was established using Allen's method.They were assessed with Basso-Beattle-Bresnahan（BBB）scale three days after injury.Then the rats were sacrificed，and the expression of microtubule associated protein 1 light chain 3（LC3）-II in spinal cord was detected with Western blotting and immunofluorescent labeling，and the number of apoptotic cells were assessed with TUNEL staining.Results The expression of LC3-II and the number of apoptotic cells increased in SCI group compared with those in Sham group（P＜0.01），while the BBB score decreased（P＜0.001）.The expression of LC3-II increased and the number of apoptotic cells decreased in ALC group compared with those in SCI group（P＜0.001），while the BBB score increased（P＜0.01）.Conclusion ALC may promote autophagy，and inhibit apoptosis to improve the locomotor function afterASCI.

acute spinal cord injury；acetyl-l-carnitine；autophagy；apoptosis；rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.07.003

R651.2

A

1006-9771（2016）07-0754-05

1.遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃項目（No.LJQ2014091）；2.遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金項目（No.XZJJ20130204）。

1.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院骨科，遼寧錦州市121001；2.撫順市中心醫(yī)院骨科，遼寧撫順市113006。作者簡介：孟慶峰（1976-），男，漢族，遼寧撫順市人，碩士研究生，副主任醫(yī)師，主要研究方向：脊髓損傷機(jī)制及治療。通訊作者：范仲凱，男，副教授。E-mail:fanzk_ln@ 163.com。

2016-02-29

2016-04-28）