徐 丹， 趙菲菲， 楊 馨， 李 靖， 徐國波， 廖尚高*

(1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004 ；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004)

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基于血清藥理學方法的頭花蓼抗炎有效提取物篩選

徐 丹1，2， 趙菲菲1，3， 楊 馨1，3， 李 靖1，2， 徐國波1，2， 廖尚高1，2*

(1.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州貴陽 550004；2.民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴州貴陽 550004 ；3.貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽 550004)

[目的]通過血清藥理學方法，研究頭花蓼不同提取物及熱淋清顆粒含藥血清對小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7細胞)釋放炎癥因子的影響，篩選出頭花蓼抗炎有效提取物。[方法]采用頭花蓼血清藥理學評價方法，10 ng/mL 脂多糖(LPS)建立RAW264.7細胞炎癥損傷模型，MTT法檢測細胞存活率，Griess試劑法檢測細胞上清液中NO的釋放量，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6的釋放量，以考察頭花蓼水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物及熱淋清顆粒含藥血清(WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS)對巨噬細胞釋放炎癥因子的影響。[結果]與模型組比較，WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS均能顯著抑制LPS刺激的RAW 264.7細胞釋放炎癥因子NO、TNF-α和IL-6，PCWEPS組抑制細胞釋放NO、TNF-α和IL-6的作用最強。[結論]頭花蓼水提醇沉提取物為頭花蓼主要的抗炎有效提取物。

頭花蓼；熱淋清顆粒；血清藥理學；RAW 264.7細胞；炎癥因子

頭花蓼為蓼科蓼屬植物頭花蓼的全草，是貴州地道藥材，收載于2003版《貴州省中藥、民族藥質量標準》，對泌尿系統(tǒng)感染類疾病有獨特療效。致病體長期侵襲尿路粘膜或組織會產生炎癥，造成尿路感染，持續(xù)的炎癥反應還將加重泌尿系統(tǒng)感染[1]。抑制炎癥反應，防止泌尿系統(tǒng)感染的惡化，對此類疾病的治療具有重要意義。以頭花蓼水提物為主要原料的熱淋清顆粒在臨床上用于治療泌尿系統(tǒng)感染，并收載于2010年版《中國藥典》。研究表明，熱淋清顆粒具有顯著的抗炎活性[2]，但臨床中每天的服用量較大[3]。為研究頭花蓼水提物經醇沉后對其本身抗炎活性的影響，該研究采用能較好地模擬藥物在體內環(huán)境中產生藥理效應真實過程的血清藥理學方法[4]，考察頭花蓼不同提取物含藥血清，即水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物及熱淋清顆粒含藥血清(WEPS、PCWEPS、RLQS)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激的小鼠單核巨噬細胞(RAW264.7 細胞)釋放炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的影響，從而篩選出頭花蓼的抗炎有效提取物。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株與動物。小鼠單核巨噬細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；Wistar大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，SPF級，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號CXK(黔)2012-0001。

1.1.2藥材。頭花蓼藥材購于貴州省施秉縣頭花蓼GAP種植基地，由貴州醫(yī)科大學生藥學教研室龍慶德副教授鑒定為蓼科蓼屬植物頭花蓼PolygonumcapitatumBuch-Ham. ex D. Don的全草。

1.1.3試劑。DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，LPS(Sigma公司)，MTT(Sigma公司)；磺胺、N-(1-萘基)-乙二胺、二甲基亞砜(DMSO)均為國藥集團產品；小鼠TNF-α ELISA試劑盒(RayBio公司)，小鼠IL-6 ELISA試劑盒(RayBio公司)。醋酸地塞米松磷酸鈉注射液(貴州光正制藥有限責任公司)，熱淋清顆粒(貴州威門藥業(yè)股份有限公司)。

1.1.4儀器。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific公司)，倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，低速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，超低溫冰箱(Thermo Fisher公司)，680型酶標儀(上海伯樂生命醫(yī)學產品有限公司)，數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)，超凈工作臺(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，所用細胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、離心管均為美國Corning公司產品。

1.2方法

1.2.1頭花蓼提取物的制備。頭花蓼全草粉末(一號篩)水提取4次，每次2 h，合并濾液回收至浸膏得頭花蓼水提物(WEP)，此為頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒的主要成分；水提物用水溶解后加入3倍量95%乙醇沉淀24 h，過濾，合并濾液回收至浸膏得頭花蓼水提醇沉提取物(PCWEP)，濾渣則為頭花蓼水提醇沉沉淀物(DPCWEP)[5]。

1.2.2空白血清和含藥血清的制備。SD大鼠50只雌雄各半，隨機分為5組，灌胃前12 h禁食不禁水，分別灌胃給予超純水、頭花蓼水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物以及熱淋清顆粒藥液[生藥量6 g/(kg·d)，頭花蓼單方制劑熱淋清顆粒的臨床劑量]，每天2 次，連續(xù)4 d[6]，末次給藥后90 min，尾靜脈取血，以2 000 r/min、4 ℃離心10 min分離上層血清，過濾除菌，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RAW264.7細胞的體外培養(yǎng)。RAW264.7細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素及100 μg/mL 鏈霉素的DMEM細胞培養(yǎng)液中，置于溫度為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于試驗。

1.2.4空白血清及含藥血清對RAW264.7細胞的影響。RAW264.7細胞用0.25%的胰蛋白酶消化，以2×105個/mL 的濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細胞培養(yǎng)24 h后，棄去上清。試驗分為：①正常對照組(CON組)，無大鼠血清的培養(yǎng)基；②試驗組，不同體積分數(shù)(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)的空白血清或含藥血清(WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS)，培養(yǎng)24 h后，每孔加入終濃度為 2.5 g/L的MTT，繼續(xù)孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在490 nm用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔吸光度值A，每組設6個平行孔。按照公式：細胞存活率(%)= 試驗組A/對照組A平均值 × 100%，計算細胞存活率。

1.2.5空白血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響。參照“1.2.4”項，每孔體積100 μL。試驗分為：①對照組(CON-1)，無大鼠血清的培養(yǎng)基；②空白血清組(CON-2)，體積分數(shù)為1.5%的空白血清培養(yǎng)液；③無血清模型組(LPS-1)，終濃度為10 ng/mL 的LPS溶液；④空白血清模型組(LPS-2)，終濃度為10 ng/mL 的LPS和空白血清體積分數(shù)為1.5%的培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)24 h后，吸取細胞培養(yǎng)液上清50 μL至酶標板中，加入等體積的Griess試劑(1%磷酸磺胺溶液與0.1% N-(1-萘基)-乙二胺等體積混合液)，室溫反應10 min后于540 nm處測定各孔吸光度A，每組設6個平行孔。用濃度為1.56、3.12、6.25、12.50、25.00、50.00 μmol/L NaNO2溶液繪制標準曲線，根據(jù)NaNO2標準曲線計算細胞培養(yǎng)液上清中NO的釋放量。

1.2.6頭花蓼及熱淋清顆粒含藥血清對細胞釋放NO的影響。參照“1.2.5”項，試驗分為①正常對照組(CON組)，無大鼠血清的培養(yǎng)基；②模型組(LPS組)，培養(yǎng)基中加入終濃度為10 ng/mL 的LPS；③地塞米松組(DEXA組)，培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μg/mL 的地塞米松和10 ng/mL 的LPS共培養(yǎng)；④頭花蓼及熱淋清顆粒含藥血清組，培養(yǎng)基中分別加入體積分數(shù)為1.5%的含藥血清(WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS)和10 ng/mL LPS共培養(yǎng)。每組設6個平行孔。根據(jù)NaNO2標準曲線計算細胞培養(yǎng)液上清中NO的釋放量。

1.2.7頭花蓼及熱淋清顆粒含藥血清對細胞釋放TNF-α和IL-6的影響的影響。參照“1.2.6”項，每組設6個平行孔，收集細胞上清液，按照相應的ELISA試劑盒說明書方法進行測定，根據(jù)試劑盒標準曲線計算各組細胞上清中TNF-α和IL-6的釋放量。

2　結果與分析

2.1空白血清及含藥血清對RAW264.7細胞的影響由表1可知，當空白血清及含藥血清的體積分數(shù)為0.5%～1.5%時，作用細胞24 h，與對照組(CON-1)比較，細胞存活率無顯著性差異。表明在此體積范圍內空白血清及含藥血清對于RAW264.7細胞本身的生長無顯著影響。超過此添加量，隨著血清體積的增加，RAW264.7細胞的生長受到顯著影響。為有效反映藥物的藥效，在后續(xù)試驗中，血清體積分數(shù)設定為1.5%。

表1空白血清及含藥血清對細胞存活率的影響(n=6)

Table 1Effects of blank serum and drug-containing serum on the viability of RAW264.7 cells

組別Group體積分數(shù)Volumefraction∥%細胞存活率Cellviability%對照組Controlgroup(CON-1)—100.00±0.50空白血清組0.5100.76±0.36Blankserumgroup(CON-2)1.0100.93±0.371.599.62±0.252.094.32±0.43**WEPS組WEPSgroup0.5100.35±0.301.0100.18±0.431.598.83±0.302.095.84±0.27**PCWEPS組PCWEPSgroup0.5100.38±0.291.0100.05±0.271.599.24±0.202.095.29±0.25**DPCWEPS組DPCWEPSgroup0.5100.74±0.361.0100.46±0.241.599.83±0.282.094.82±0.54**RLQS組RLQSgroup0.5100.46±0.221.0100.25±0.181.599.04±0.432.095.47±0.50**

注：**表示與對照組比較P<0.01。

Note: Compared with control group, ** wasP< 0.01.

2.2空白血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響由表2可知，采用1.5%體積的空白血清作用于10 ng/mL LPS誘導的RAW264.7細胞24 h，與空白對照組比較，無血清模型組(LPS-1，相對于CON-1)和空白血清模型組(LPS-2，相對于CON-2)均有顯著性差異(P<0.01)，表明細胞炎癥模型建立成功；空白血清組(CON-2)與對照組(CON-1)比較無顯著性差異，空白血清模型組(LPS-2)與無血清模型組(LPS-1)比較也無顯著性差異，表明當空白血清體積為1.5%時，既不影響RAW264.7細胞的生長，也不影響LPS刺激所產生的NO釋放的檢測，以此確定試驗中含藥血清的添加體積為1.5%。同時，采用無血清模型組(LPS-1)作為后續(xù)試驗的模型組(LPS)。

表2　空白血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響(n=6)

注：##表示與CON-1組比較P<0.01；**表示與CON-2組比較P<0.01。

Note: Compared with CON-1 group，## wasP< 0.01. Compared with CON-2 group，** wasP< 0.01.

2.3頭花蓼及熱淋清顆粒含藥血清對細胞釋放NO的影響由表3可知，與對照組比較，模型組(LPS組)顯著誘導RAW264.7細胞釋放NO(P<0.01)；與模型組比較，WEPS、PCWEPS、RLQS均能不同程度地抑制RAW264.7細胞釋放NO(P<0.05或P<0.01)；與PCWEPS組比較，WEPS組和RLQS組NO的釋放量具有顯著性差異(P<0.01)。因此，PCWEPS具有較強地抑制細胞釋放NO的作用。

表3含藥血清對RAW264.7細胞釋放NO的影響(n=6)

Table 3Effect of drug-containing serum on NO production in RAW264.7 cells

組別Group體積分數(shù)Volumefraction∥%NOμmol/L對照組(CON)Controlgroup—2.08±0.26模型組(LPS)Modelgroup—16.93±0.45##DEXA組DEXAgroup—5.57±0.30**WEPS組WEPSgroup1.515.61±0.26*△△PCWEPS組PCWEPSgroup1.513.95±0.18**DPCWEPS組DPCWEPSgroup1.516.37±0.33RLQS組RLQSgroup1.515.41±0.31**△△

注：##表示與對照組比較P<0.01；*、**分別表示與模型組比較P<0.05、P<0.01；△△表示與PCWEPS組比較P<0.01。

Note：Compared with control group，## wereP<0.01. Compared with model group，* and ** wasP<0.05 andP<0.01，respectively. Compared with PCWEPS group，△△ indicatedP<0.01.

2.4頭花蓼及熱淋清顆粒含藥血清對細胞釋放TNF-α和IL-6的影響由表4可知，與對照組比較，模型組顯著誘導RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6(P<0.01)；與模型組比較，WEPS、PCWEPS、DPCWEPS、RLQS均能不同程度地抑制RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6(P<0.01)；與PCWEPS組比較，WEPS、DPCWEPS、RLQS組TNF-α和IL-6的釋放量具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。因此，PCWEPS具有較強地抑制細胞釋放TNF-α和IL-6的作用。

表4　含藥血清對RAW264.7細胞釋放TNF-α和IL-6的影響 (n=6)

注：##表示與對照組比較P<0.01；**表示與模型組比較P<0.01；△、△△分別表示與PCWEPS組比較P<0.05、P<0.01。

Note：Compared with control group，## wereP<0.01. Compared with model group，** wereP<0.01. Compared with PCWEPS group，△ and △△ indicatedP<0.05 andP<0.01，respectively.

3　討論與結論

LPS誘導RAW264.7細胞的體外炎癥模型被廣泛用于抗炎藥物的評價[7]。當機體發(fā)生炎癥時致炎物質和炎癥介質會增加NO的合成和釋放，過量的NO及其穩(wěn)定性衍生物過氧亞硝基陰離子對細胞具有毒性作用，因此限制NO的過量釋放可以預防和治療炎癥[8]；TNF-α 作為一個重要的早期炎癥因子可誘發(fā)IL-6以及繼發(fā)性炎癥介質NO的釋放[9]，因此抑制TNF-α 的釋放在治療炎癥的過程中也顯得尤為重要；現(xiàn)有研究表明在多種炎癥相關疾病中均伴有明顯的IL-6水平升高，因此IL-6表達水平也是常用的抗炎檢測指標[10]。該研究發(fā)現(xiàn)，頭花蓼各提取物及熱淋清顆粒含藥血清均能夠抑制RAW264.7細胞釋放炎癥因子NO、TNF-α及IL-6，其中頭花蓼水提醇沉提取物含藥血清抑制細胞釋放炎癥因子的作用最強，因此其為頭花蓼主要的抗炎有效物質。

4組含藥血清抑制LPS刺激RAW264.7細胞釋放NO、TNF-α、IL-6的作用強度從強到弱依次為PCWEPS、RLQS、WEPS、DPCWEPS。頭花蓼水提醇沉沉淀物中主要為多糖和蛋白類化合物，其抗炎活性較弱。熱淋清顆粒以頭花蓼水提物為主要原料，可能是由于熱淋清顆粒的制備工藝較為成熟使其更易于吸收，導致其含藥血清的抗炎活性略優(yōu)于頭花蓼水提物含藥血清的抗炎活性。PCWEPS的抗炎活性最強，可能是由于乙醇沉淀法有效除去蛋白質、多糖、鞣質等雜質，有效成分得到富集[3]，其中富含槲皮素、沒食子酸、山奈酚、兒茶素以及多種酚酸類等化合物[11]，使其含藥血清的抗炎活性得到較大程度的提高，這為改善熱淋清顆粒臨床用量較大提供了理論依據(jù)。

綜上所述，頭花蓼水提物、水提醇沉提取物、水提醇沉沉淀物及熱淋清顆粒含藥血清均能不同程度地通過抑制炎癥因子NO、TNF-α和IL-6的釋放而發(fā)揮抗炎作用，其中頭花蓼水提醇沉提取物為頭花蓼主要的抗炎有效物質，因此采用水提后醇沉的方法能夠提高頭花蓼的抗炎活性，這為從細胞水平上深入探討頭花蓼在治療泌尿系統(tǒng)感染中的作用奠定了基礎，也為頭花蓼的進一步開發(fā)應用提供了理論依據(jù)。

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Screening of Effective Anti-inflammatory Extracts fromPolygonumcapitatumBased on Serum Pharmacological Method

XU Dan1, 2，ZHAO Fei-fei1, 3，YANG Xin1, 3, LIAO Shang-gao1, 2*et al

(1. School of Pharmacy, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004; 2. Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and TCM, Ministry of Education, Guiyang, Guizhou 550004; 3. Guizhou Provincial Key Laboratory of Pharmaceutics, Guiyang, Guizhou 550004)

[Objective] To research the effects of different extracts fromPolygonumcapitatumand drug-containing serum of Relinqing granules on releasing inflammatory factor of mouse monocyte-macrophage (RAW264.7 cell) by serum pharmacological method, and to screen effective anti-inflammatory extracts fromP.capitatum. [Method] Serum pharmacological evaluation method ofP.capitatumwas adopted. The inflammatory cell model was produced by LPS (10 ng/mL)-treated RAW264.7 cells. The cell viability was detected by MTT method. NO production was detected by the Griess assay, TNF-α and IL-6 were quantitated by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in the cell culture supernatant to investigate the effect of drug-containing serum ofPolygonumcapitatumof its water extract (WEPS), protein-free water extract (PCWEPS), deposition of protein-free water extract (DPCWEPS) and Relinqing granules (RLQS) on inflammatory cytokines in macrophage cells. [Result] The drug-containing serums could significantly inhibit the release of NO, TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7 cells compared with the model group (P<0.05,P<0.01), in which PCWEPS had the best effect on NO, TNF-α and IL-6 inhibitory. [Conclusion] Protein-free water extract ofPolygonumcapitatumis the main extract for anti-inflammatory.

Polygonumcapitatum; Relinqing granules; Serum pharmacology; RAW264.7 cells; Inflammatory cytokines

國家自然科學基金項目(81160516，81560570)。

徐丹(1991- )，女，江蘇鎮(zhèn)江人，碩士研究生，研究方向：藥物化學。*通訊作者，教授，博士，碩士生導師，從事天然藥物的化學、藥理和代謝研究。

2016-05-16

S 567.23+9

A

0517-6611(2016)17-134-03