倪 悅，徐 達，孫 強，鄧 宇，田耀偉，陳若星

(江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，江西南昌 330096)

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蒲公英綠原酸的酶法提取及其在卷煙中的應(yīng)用

倪 悅，徐 達，孫 強，鄧 宇，田耀偉*，陳若星

(江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心，江西南昌 330096)

[目的] 研究不同提取方法對蒲公英綠原酸提取效率的影響并完成工藝優(yōu)化，通過加料評吸試驗為蒲公英綠原酸在卷煙中的應(yīng)用提供參考。[方法]采用3種提取方法對蒲公英綠原酸進行提取，針對酶解醇提法進行工藝優(yōu)化，考察酶液添加量、料液比、酶解溫度、酶解時間對綠原酸提取效率的影響，并通過正交試驗確定最優(yōu)工藝條件。[結(jié)果]最優(yōu)工藝條件為：酶液添加量為3mL，料液比為1∶12g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為3h。按照上述最優(yōu)工藝條件制備得到的蒲公英提取物中，綠原酸提取率可達5.33mg/g。將該提取物產(chǎn)品按照0.1%加料進行卷煙應(yīng)用研究，結(jié)果顯示：卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡。[結(jié)論]酶解醇提法在蒲公英綠原酸提取中具有較高的效率，該提取物應(yīng)用于卷煙中能顯著提高煙氣的感官舒適性，在煙用香料領(lǐng)域有一定的應(yīng)用前景。

蒲公英；綠原酸；酶解；工藝優(yōu)化

蒲公英，別名黃花地丁、黃花三七、婆婆丁等，原產(chǎn)于歐洲，臨床常用中藥，有清熱解毒、消腫散結(jié)、利尿通淋之功效。蒲公英提取物中含有大量的多糖類、有機酸類等多種活性成分，其中的綠原酸是一種多酚類物質(zhì)，具有重要的生理活性。試驗證明，蒲公英中的有機酸(以綠原酸為主)可以明顯降低煙氣刺激性，提高香氣質(zhì)量，故而蒲公英提取物常被用作煙用香料應(yīng)用于卷煙中。

目前，國內(nèi)針對蒲公英的提取研究較多，但提取手段十分單一，主要是水提、醇提法[1]。近年來，有研究者采用纖維素酶對蒲公英進行了初步的探索，但未對酶解法提取優(yōu)勢進行闡述，缺乏各種工藝方法間的提取效率對比。鑒于此，筆者通過3種提取工藝對比篩選后，采用復(fù)合植物水解酶ViscozymeL先對蒲公英的細胞壁物質(zhì)進行預(yù)處理，提高其中綠原酸等有機酸的溶出率，然后采用50%的醇水體系對蒲公英綠原酸進行提取，最后針對該提取物進行了卷煙加料應(yīng)用研究。目前，綠原酸提取的原料主要是金銀花、杜仲葉、甘薯、杭白菊、牛蒡葉等[2-3]，該研究為這類天然本草提取物在卷煙中的應(yīng)用提供了技術(shù)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料蒲公英，江西匯仁藥業(yè)有限公司，粉碎過40 目篩；復(fù)合植物水解酶ViscozymeL(酶活≥100FBG/g，F(xiàn)BG為真菌β-葡聚糖酶單位)，諾維信公司，使用前配成 1g/L酶溶液；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%)，北京中科三捷生物有限公司；殼聚糖、無水乙醇，均為分析純。

主要儀器設(shè)備：MRHei-standard磁力加熱攪拌器，德國Heidolph公司；LX-300冷卻水循環(huán)機，北京長流科學(xué)儀器公司；CP2245電子天平，德國Sartorius公司；Lambda750紫外分光光度計，美國PE公司；HW·YS型數(shù)顯恒溫水浴鍋，浙江舟山市定海區(qū)海源儀器廠。

1.2蒲公英綠原酸的提取

1.2.13種提取工藝。工藝A(酶解醇提法)：準(zhǔn)確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，按照1∶10g/mL的料液比用10g去離子水作為溶劑，加入2mL酶液進行酶解，控制酶解溫度45 ℃，酶解時間為2h。完成后，加入10g乙醇(50%醇水體系)進行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得。

工藝B(酶解水提法)：準(zhǔn)確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，首先采用10g去離子水作為溶劑，加入2mL酶液進行酶解，pH保持自然狀態(tài)，45 ℃水浴2h。完成后，提高溫度至100 ℃進行水浴回流2h，之后加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得[4]。

工藝C(醇提法)：準(zhǔn)確稱取1g蒲公英干粉置于50mL的圓底燒瓶中，采用50%乙醇溶液20g作為提取溶劑，搖勻，密封置于水浴鍋中水浴(80 ℃)回流2h，加入3mL10g/L殼聚糖溶液，靜置2h，抽濾、濃縮至10g即得[5-6]。

1.2.2影響蒲公英綠原酸提取效率的單因素試驗。

1.2.2.1酶液添加量。按照“1.2.1”的工藝A試驗方法，控制液料比為1∶10g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2h，考察酶液添加量(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mL)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.2料液比。根據(jù)“1.2.2.1”的試驗結(jié)果選擇最優(yōu)的酶液添加量，控制酶解溫度為45 ℃，酶解時間為2h，考察料液比(1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶15g/mL)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.3酶解溫度。根據(jù)“1.2.2.1”和“1.2.2.2”的試驗結(jié)果選擇最優(yōu)的酶液添加量、料液比，控制酶解時間為2h，考察酶解溫度(25、35、45、55、65 ℃)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.2.4酶解時間。根據(jù)“1.2.2.1、1.2.2.2、1.2.2.3”的試驗結(jié)果，選擇最優(yōu)的酶液添加量、料液比、酶解溫度，考察酶解時間(分別為0.5、1.0、2.0、3.0、4.0h)對蒲公英綠原酸提取效率的影響。

1.2.3蒲公英綠原酸提取工藝的正交優(yōu)化試驗。根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，按照表1設(shè)計安排正交試驗L9(34)，考察4個因素對蒲公英綠原酸提取效率的綜合影響[7]。

表1蒲公英綠原酸提取效率的正交試驗因素水平

Table1Factorsandlevelsoforthogonaltestontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion

水平Level因素Factor酶液添加量Enzymedosage(A)∥mL料液比Solid-liquidratio(B)g/mL酶解溫度Enzymolysistemperature(C)∥℃酶解時間Enzymolysistime(D)∥h111∶10351221∶12452331∶15553

1.3測定項目及方法

1.3.1綠原酸提取率測定。將提取物產(chǎn)品置于50mL容量瓶中定容，取200μL樣品溶液于10mL容量瓶中，放在60 ℃干燥箱中烘干，并用50%乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù))定容，于波長327nm處測定吸光度，得到綠原酸的提取率。

綠原酸提取率=提取液中綠原酸質(zhì)量(mg)/蒲公英干粉質(zhì)量(g)

1.3.2蒲公英提取物在卷煙中的應(yīng)用結(jié)果。采用金圣(軟紅)空白葉組，將3種不同制備工藝得到的蒲公英提取物添加到金圣(軟紅)葉組中，添加量為0.1%(以煙絲重量為基準(zhǔn))，參考中式卷煙風(fēng)格感官評價方法[8-9]，組織5位評煙委員進行感官評吸，篩選出最優(yōu)的制備方法。另外，采用香味輪廓法[10]針對工藝優(yōu)化后的蒲公英提取物進行評吸，探索該蒲公英綠原酸在卷煙中的應(yīng)用效果。

2　結(jié)果與分析

2.1綠原酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用50%的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù))配制42.5μg/mL綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于分光光度計中于波長200～500nm范圍內(nèi)進行掃描，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液作參比，結(jié)果表明，在波長327nm處有最大吸收峰[11]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取以上綠原酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1、2、3、4、5mL，分別置于6個 10mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液定容，搖勻。在波長327nm處分別測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以綠原酸標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，回歸方程為y=0.048 5x+0.098 6，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，結(jié)果表明，在0～0.223 3μg/mL的濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。

圖1　綠原酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of chlorogenic acid concentration

2.23種提取工藝的提取效率比較3種提取工藝的提取效率見圖2，工藝A(酶解醇提法)的綠原酸提取率為3.85mg/g，顯著優(yōu)于工藝B(0.84mg/g)和工藝C(2.38mg/g)。綠原酸易溶于乙醇，在水中的溶解度很小，所以工藝A、工藝C優(yōu)于工藝B。另外，工藝A中，采用復(fù)合纖維素酶可以有效地針對蒲公英細胞壁物質(zhì)進行水解，顯著促進提取效率，生成的還原糖類等小分子物質(zhì)則對卷煙提質(zhì)有積極的促進作用。

圖2　3種蒲公英綠原酸的提取工藝比較Fig.2　Comparison of three extraction technologies of chlorogenic acid

將3種不同制備工藝得到的蒲公英提取物添加到金圣(軟紅)葉組中，添加量為0.1%(以煙絲重量為基準(zhǔn))，不經(jīng)加香直接手工卷制，平衡水分，參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進行感官評吸。由表2可知，4款卷煙評吸結(jié)果為：工藝A>工藝C>工藝B>空白；對比空白卷煙，添加了蒲公英提取物的卷煙在香氣質(zhì)量以及木質(zhì)雜氣方面有了整體的提高；工藝A制備得到的樣品整體得分最高，木質(zhì)氣息和刺激性明顯減輕，潤感明顯，香氣質(zhì)有提高，協(xié)調(diào)性相對較好，余味舒適。故接下來采用工藝A針對蒲公英進行酶解醇提法工藝優(yōu)化試驗。

表2　3種蒲公英提取物的評吸結(jié)果比較

2.3蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝優(yōu)化蒲公英的酶解醇提工藝優(yōu)化首先針對酶液添加量、液料比、酶解溫度、酶解時間進行單因素優(yōu)化，然后根據(jù)單因素優(yōu)化結(jié)論進行正交試驗。

2.3.1酶液添加量對綠原酸提取率的影響。由圖3可知，綠原酸提取率隨著酶液添加量的增加而提高，在添加量為2mL后則提取率增加不明顯?？紤]到經(jīng)濟性，確定2mL為最佳酶液添加量。

圖3　酶液添加量對綠原酸提取率的影響Fig.3　Effects of enzyme dosage on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.2料液比對綠原酸提取率的影響。由圖4可知，綠原酸提取率隨著液料比中溶劑用量的增加而提高，在料液比1∶12g/mL后提取率增加不明顯?？紤]到經(jīng)濟性，確定1∶12g/mL為最佳料液比。

圖4　料液比對綠原酸提取率的影響Fig.4　Effects of solid-liquid ratio on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.3提取溫度對綠原酸提取率的影響。由圖5可知，綠原酸提取率隨著提取溫度的升高先增加后降低，在溫度為45 ℃時提取率達到最高，繼續(xù)提高溫度則提取率降低。這可能是由于溫度過高，復(fù)合酶活性降低導(dǎo)致。

圖5　提取溫度對綠原酸提取率的影響Fig.5　Effects of enzymolysis temperature on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.4提取時間對綠原酸提取率的影響。由圖6可知，綠原酸提取率隨著提取時間的增加而增加，在時間為2h時提取率達到較高水平，繼續(xù)增加提取時間則提取率增加不明顯。故選擇2h為最優(yōu)的酶解時間。

圖6　提取時間對綠原酸提取率的影響Fig.6　Effects of enzymolysis time on the extraction rate of chlorogenic acid

2.3.5蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝的正交試驗。由表3可知，以蒲公英綠原酸的提取率為評價標(biāo)準(zhǔn)，影響提取率酶解醇提工藝的因素大小依次為酶解溫度、酶解時間、酶液添加量、料液比。最佳工藝條件為A3B2C2D3，即酶液添加量為3mL、料液比為1∶12g/mL、酶解溫度為45 ℃、酶解時間為3h。經(jīng)檢測，按照上述工藝條件制備得到蒲公英提取物中綠原酸提取率為5.33mg/g。

2.4含綠原酸的蒲公英提取物在卷煙中的應(yīng)用采用香味輪廓分析法進行5人次評吸，結(jié)果如圖7和8所示，可以看到，隨著蒲公英提取物添加量的提高，卷煙的清香和甜香有了較為明顯的增強，并且在刺激性、干燥感和香氣的細膩感上有了較為明顯的增強[12]。在三類卷煙金圣(軟紅)空白葉組中添加量為0.1%時，卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡，為該蒲公英提取物在此款卷煙中較為合適的添加比例。

表3蒲公英綠原酸的酶解醇提法工藝的正交試驗結(jié)果

Table3Orthogonaltestresultsofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodofchlorogenicacidfromdandelion

試驗號TestNo.因素FactorABCD綠原酸提取率Extractionrateofchlorogenicacid∥mg/g111112.55212224.62313334.01421235.04522313.87623124.23731324.33832134.56933214.67k13.733.973.783.70k24.384.354.784.39k34.524.304.074.54R0.790.381.000.84

3　結(jié)論與討論

通過對蒲公英綠原酸3種提取工藝的篩選，采用酶解醇提法具有較高的提取效率，并通過正交試驗確定了最優(yōu)工藝條件：酶液添加量為3mL，料液比為1∶12g/mL，酶解溫度為45 ℃，酶解時間為3h，按照上述最優(yōu)工藝條件制備得到的蒲公英提取物中綠原酸提取率可達5.33mg/g。該提取物按照0.1%加料添加在卷煙中，卷煙的甜潤感、刺激性、余味、干燥感均有較為明顯的提升，同時在煙香和香氣濃度上損失也較小，總體較為均衡。

圖7　中式卷煙風(fēng)格感官評價結(jié)果(未添加蒲公英提取物)Fig.7　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(not adding dandelion extracts)

圖8　中式卷煙風(fēng)格感官評價結(jié)果(添加0.1%蒲公英提取物)Fig.8　Sensory evaluaion results of Chinese style cigarette(adding 0.1% dandelion extracts)

該研究將酶技術(shù)應(yīng)用在了蒲公英綠原酸的提取中，相對于綠原酸提取領(lǐng)域單一的方式方法有一定的借鑒意義。目前，多項研究表明，綠原酸對卷煙抽吸品質(zhì)有積極的提升效

果，該研究提取得到的蒲公英綠原酸將在卷煙香料領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用前景。

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EnzymaticExtractionofChlorogenicAcidfromDandelionandItsApplicationinCigarette

NIYue,XUDa,SUNQiang,TIANYao-wei*etal

(TechnologyResearchCenter,ChinaTobaccoJiangxiIndustrialCorporation,Nanchang,Jiangxi330096)

[Objective]Toresearchtheeffectsofextractionmethodsontheextractionrateofchlorogenicacidfromdandelion,tooptimizethetechnology,andtoprovidereferencesfortheapplicationofchlorogenicacidincigarettebysmokepaneltest. [Method]Chlorogenicacidwasextractedfromdandelionbythreemethods.Technologyoptimizationofenzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodwascarriedout.Effectsofenzymedosage,solid-liquidratio,enzymolysistemperatureandenzymolysistimeontheextractionrateofchlorogenicacidwereresearched.Theoptimaltechnologyconditionwasconfirmedbyorthogonaltest. [Conclusion]Theoptimaltechnologyconditionwasasfollows: 3mLenzymedosage, 1∶12g/mLsolid-liquidratio, 45 ℃enzymolysistemperature,and3henzymolysistime.Underthiscondition,theextractionrateofchlorogenicacidindandelionextractswas5.33mg/g.Theextractswereusedforcigaretteaccordingtothepercentageof0.1%.Resultsshowedthatthesweet,irritation,aftertaste,drynessofcigarettewereimprovedobviously,withlowerlossoftobaccoaromaandaromaconcentration. [Conclusion]Enzymatichydrolysisandalcoholextractionmethodhasrelativelyhighefficiencyintheextractionofchlorogenicacidfromdandelion.Applyingtheextractsincigarettesignificantlyenhancesthesensorycomfortlessof,whichisofcertainapplicationprospectinthefieldoftobaccoflavors.

Dandelion;Chlorogenicacid;Enzymaticextraction;Technologyoptimization

江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目(贛煙工科計2014-05)。

倪悅(1985-)，男，江蘇蘇州人，助理工程師，碩士，從事卷煙產(chǎn)品研發(fā)。*通訊作者，工程師，碩士，從事卷煙香精香料開發(fā)與應(yīng)用研究。

2016-05-03

TQ914.1

A

0517-6611(2016)17-107-04